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作者：孟繁凯 李光民 范洪学作者单位：吉林大学公共卫生学院，吉林 长春 130021 + w8 D& m8 }3 M9 W$ G2 N5 F
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! m' j( L. h" k, R, X+ j 【摘要】 目的 探讨体外培养、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法，诱导MSCs向神经元样细胞定向分化。方法 取大鼠骨髓，采用贴壁培养筛选法分离MSCs，进行培养扩增，观察其生物学特性；用IBMX诱导MSCs 向神经元样细胞分化，并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。结果 大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离，并可在体外大量扩增，经IBMX诱导，MSCs 可向神经元样细胞分化，出现胞体和突起，细胞免疫化学染色神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白呈阳性。结论 MSCs 易分离和培养，体外培养条件下生长良好，可连续传代，诱导剂作用下可分化出神经元样细胞。 & N1 ^, D. _( e) @ h
【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导剂；IBMX；细胞培养；神经元" [ J( o, x4 q5 i: h6 F
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs) 是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最多，胎儿脐血中亦可分离得到〔1〕。在一定的诱导条件下MSCs具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等中胚层细胞分化的能力; 同时可以向外胚层的神经细胞及内胚层的肝卵圆性细胞分化〔2,3〕，并在体外一定诱导条件下分化为神经元样细胞，在神经组织损伤修复方面具有广阔的应用前景〔4,5〕。因此本研究着重探讨MSCs 的分离培养条件及其生物学特性，探讨体外条件下MSCs 向神经元样细胞分化能力,为中枢神经系统疾病的细胞治疗提供可靠的理论依据。
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1 材料和方法% j9 U, v! R0 \1 w# w4 b" F
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4周龄健康Wistar 大鼠，体重120～130 g，由吉林大学实验动物中心提供。
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12方法
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- P7 I0 l& G# } 121主要试剂5 f. W8 z6 m# S7 T$ ?% s
3 B, ]2 v! H" s3 \! |1 Q 低糖DMEM 培养基(LDMEM,GIBCO 公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，胰蛋白酶(GIBICO 公司)，荧光标记鼠抗CD45FITC、CD29FITC (BD phamingen 公司)，CD44FITC、CD11bFITC(Serotec 公司)，βME(Amresco 公司),碱性成纤维生长因子(bFGF，R&D 公司)，兔抗大鼠特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、GFAP 多克隆抗体、SABCFITC 试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。# K( o. X& h$ i+ Q; S: j( S& e$ R
/ b7 H7 k2 F* w6 [; J. }* | 122MSCs的分离、原代培养
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) b- u8 b, K' D1 O/ h7 k- S 大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取股骨，用DMEM冲出骨髓，离心去除上清及脂肪，以5106／ml的细胞密度接种于75 ml培养瓶中，加入DMEM培养液，10％FCS，37℃、5％CO2培养，4～5 d后换液，以后每隔3～4 d换液一次。
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123MSCs 传代培养) W0 p. |/ `$ T. l+ K: F+ w
, o0 Y, Z' s5 E( S# ` 当细胞生长至约90%融合时，用含01 mmol/L EDTA 的025%胰酶室温下消化约1～2 min，当细胞变圆，少量细胞悬起时加含血清的培养基终止消化、离心，去上清液，以含10鸖 的LDMEM重悬沉淀，而后按1∶2 比例传代接种。倒置显微镜观察细胞生长情况，细胞接近90%融合时重复上述操作，反复传代扩增。
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Q& L- L" c" I; s' b! }; v 124MSCs 的鉴定
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3 h% {. }! K$ U) n1 m 培养细胞胰酶消化，PBS 洗涤3 次，加入荧光标记的CD45、CD29 、CD44 和CD11b抗体。4℃孵育30 min，PBS 洗去未标记抗体，1%多聚甲醛固定15 min，应用FACScan 流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。 v8 C# @; u$ a- @. x- g/ R- X
+ j! `+ p: N7 ~" R- k% R7 V% R 125MSCs 的定向诱导分化
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9 P. k9 E* t6 m$ l# }2 z& z" |/ C0 S 将2～4代的骨髓MSCs接种在铺有盖玻片的24孔板中。分为对照组、诱导剂组。对照组中不加诱导剂，诱导剂组加入终浓度为05 mmol/L IBMX。3 d后换液，一直培养到第6天。
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3 a2 {1 n4 c! o' { 126 神经元样细胞的免疫组化鉴定
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8 j+ t2 g; Y. |, U IBMX 作用2 d，将诱导细胞用95%乙醇固定30 min，洗涤后正常山羊血清封闭，分别加入兔抗大鼠NSE 多抗(1∶100 稀释)、Nestin 多抗(1∶100 稀释)、GFAP 多抗(1∶100 稀释)，湿盒中4℃过夜后洗涤，生物素标记的第二抗体37 ℃孵育30 min，链霉菌抗生物素蛋白2过氧化酶溶液37 ℃孵育30 min，DAB 溶液显色,苏木素复染,镜下观察,计数阳性细胞。以PBS 代替一抗作阴性对照,以培养的神经元细胞作阳性对照。
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2 结果) L2 {7 J+ {7 y# w
" ]) ]/ M0 x# b% L 21MSCs 的分离和传代培养
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细胞接种72 h 后,大部分细胞贴壁,并延伸呈现成纤维样细胞形态,细胞呈梭形,细胞核较大,扁圆形，以后逐渐增多。4～5 d 后进行初次换液,以后每3 d换液1 次。5～6 d 出现多个细胞组成的细胞克隆,15～20 d 细胞融合成单层,排列有一定的方向性。传代的细胞迅速贴壁,融合后都呈梭形。传至11 代,细胞增长速度开始下降,需4～5 d 才达到融合,并且开始呈现衰老状态,表现为细胞折光性减弱,胞体内颗粒增多。4 x9 O) d$ D' `8 U
2 C: t9 J' R) z1 X 22形态学观察' g" e" A7 H( J* \: \% y+ X
7 E1 W9 W4 U/ d1 y& N1 h* P0 \ 诱导剂组出现不同数量的分化细胞,这些细胞体积小于特异标志阴性的细胞,呈圆形、卵圆形,胞浆内有棕黄色颗粒,胞核深蓝色，胞质向胞核收缩，呈典型的核周体形态，大多数细胞转变为类似于神经元的形态，有长的突起，5 h 后绝大多数细胞形态变为神经元样，相互之间连接呈网状。阴性细胞胞浆不着色,一般胞核较大,扁圆形,胞核浅蓝色（图1）。: q6 \$ ~3 F2 U8 d
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23免疫细胞化学分析0 X% O- X3 h7 U: x% r9 a: _
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用细胞免疫荧光方法鉴定发现诱导后多数细胞NSE 反应阳性，部分细胞Nestin 阳性，在蓝光下胞浆呈绿色，而胞核不显色，说明抗原在细胞浆内表达，染色具有特异性。GFAP 反应均为阴性，对照组及脑组织均浆的MSCs 呈阴性。 E8 o3 n4 m4 E2 k0 c0 M
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3 讨 论3 N8 \5 z. b# ~0 W( S
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目前MSCs 的分离纯化尚无统一的方法，比较常用的是密度梯度离心法〔6〕，这一方法分离的原代细胞较纯，但是操作较为繁琐,同时增加污染机会。本研究采取贴壁分离法，根据MSCs 贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行分离。原代培养后通过24 h 半量换液，3 d 全量换液，可以去除大部分的红细胞、粒细胞和血小板等杂质细胞，并且随着不断传代，得到较纯的MSCs。有报道MSCs诱导形成的神经元样细胞表达神经丝蛋白、NSE、神经元特异性核蛋白以及微管相关蛋白Tau〔7,8 〕。本实验通过诱导剂诱导MSCs，在很短时间内细胞出现了神经元样形态学改变,经免疫组织化学鉴定这种神经元样细胞诱导后多数细胞NSE 反应阳性，部分细胞Nestin 阳性。但是通过目前的免疫学和形态学的方法均不能完全证明诱导的细胞为神经元，只能称为神经元样细胞，只有证实诱导分化的细胞具有神经元所特有的功能(可兴奋性、可分泌神经递质并具备神经递质受体等)后，才能进一步证实MSCs 具有神经元分化潜能〔9〕。MSCs 是骨髓细胞的一个组成部分,虽然骨髓中MSCs 的含量很低，约为0001%～001%左右，但与胚胎干细胞和神经干细胞比较,MSCs 来源广,取材容易,易于分离,对机体损伤小,利用患者本人的骨髓获取的MSCs可避免免疫排斥反应,更易于临床应用。通过体外增殖可以得到移植治疗需要数量的MSCs〔10〕。在本实验中经原代和传代培养，MSCs呈指数扩增，3～5 代的细胞纯度较高并且增殖能力强，适合于进行体外实验和移植治疗。因此,在中枢神经系统疾病的细胞治疗中,MSCs 是很好的细胞来源。本文初步探讨了MSCs 体外培养的实验条件和生物学特性，并在一定程度上证实通过某些诱导剂可在体外诱导MSCs 分化为神经元样细胞，这将为进一步研究和应用MSCs 提供实验基础，并为中枢神经系统疾病的治疗提供理论依据和新的思路。; O* V* U5 e) ]! a
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发表于 2009-3-3 12:30
发表于 2015-5-24 09:43
