明天做传代了。有人有失败经验分享吗？

王乾

首先，冻细胞的时候一定要遵循慢冻的原则，一般为一分钟降一度为好。我一般是把冻存盒先放在室温一段时间，大概升到室温或低一些，再把装好细胞的冻存管放进去，盖好盖子，放到-80，三小时或过夜后转移到液氮或-150。还有，我一般喜欢提前配2*的冻存液，用起来方便。) b' s: H/ ?. |, x4 r: D
其次，复苏细胞时一定要速溶，从液氮中取出细胞，如果液氮罐离细胞房较远，可以把细胞放到冻存盒里带过去（切忌：此时的冻存盒一定是刚从-80拿出来的)。复苏时一般是把冻存管浸在37度水浴里，轻轻摇动冻存管，这样化冻的更快。化好后，把细胞转移到15ml的离心管里，加5ml的DMEM或PBS，1000rpm/min离心3分钟，去掉上清，培养基重悬，最后接到培养皿里。这一步如果没做好的话细胞会死很多，甚至全军覆没！！！/ P# L, ~) a% A0 y: Y
另外传代的方法我也想说一下，我们一般是先用PBS把细胞轻轻冲洗一下，吸去PBS，然后加适量的胰酶，消化一定时间（不同细胞会差很多，一般为细胞刚从培养皿上脱落为宜），然后加一定量的DMEM（一定是含血清的，只有血清才能终止胰酶），此时细胞应该还是有一些大块粘连的，用1ml的移液枪轻轻吹打，原则是吹打成单细胞为止，自己最好积累点经验。然后把细胞转移到15ml的离心管中，1000rpm/min离心3分钟，去上清，培养基重悬接入培养皿。我对比过离心重悬和不离心直接传代，前者传代的细胞状态会好很多，细胞的状态对实验很重要哟。