骨髓来源成骨细胞体外成骨表达的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:31 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：沙子义  刘新晖  于晓光  张国平  李亚丽  董威  任立中  高宏阳  赵峰  王伟作者单位：050031  石家庄市，河北医科大学第一医院骨科

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      【摘要】  　　目的  探索在体外诱导兔骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)向成骨细胞分化及成骨表达的特性。方法  抽取兔骨髓，通过离心法获取单个核细胞，在体外经条件培养基培养21 d，通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞的形态学特点；应用MTT法测定成骨细胞活性；并检测成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性及形成矿化结节情况。结果  体外BMSCs可在成骨条件培养液下诱导培养后可向成骨细胞分化，经倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察证实，诱导后BMSCs由长梭形转变为短胖形的成骨细胞，MTT检测成骨细胞活性良好，分泌碱性磷酸酶并形成矿化结节。结论  骨髓基质干细胞在体外可定向诱导为成骨细胞，并具有成骨细胞功能，有希望成为理想的种子细胞应用于临床。
      【关键词】组织工程骨髓基质干细胞成骨细胞
   　　Study on the osteogenesis expressing of osteoblast from bone marrow in vitro7 K; Z. @' _. R% n3 k! N& e

　　SHA Ziyi，LIU Xinhui,YU Xiaoguang,et al.

　　Department of Orthopaedics，The First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031/ ?! D$ `% {7 Z8 I7 L! z

　　【Abstract】ObjectiveTo study the bone tissue osteogenesis ability of osteoblast induced by bone marrow stem cells(BMSCs) in vitro.MethodsThe BMSCs were separated by gradient centrifugation on percoll from rabbit bone marrow, then observing and testing the biologic characters of BMSCs induced by culturing with a conditional medium for 21day.ResultsOsteoblast can be induced from BMSCs by conditional medium, moreover it can secret ALP and format the calcific nodules.ConclusionBMSCs can be induced successfully to osteoblast and express the osteogenesis function in vitro and can be used as ideal seed cells for bone tissue engineering.2 Z4 W; j7 i6 d. C" X  A' J1 `7 E5 q/ G

　　【Key words】tissue engineering; bone marrow stem cell; osteoblast6 s2 x6 b! S2 P8 ~

　　成骨细胞是骨组织工程学的首选种子细胞。目前成骨细胞的来源主要有骨膜、骨髓、骨、骨外组织，胚胎干细胞。来源于骨膜、骨松质、骨外组织，不仅来源有限，取材困难，而且对机体损伤大。而胚胎干细胞来源的成骨细胞也受到取材、免疫及伦理道德方面的限制。而骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)具有来源丰富，取材方便且安全，对人体损伤极小等优点。本实验探索了从骨髓分离出的基质干细胞体外诱导为成骨细胞的方法，并对其成骨能力进行了观察，为组织工程学寻找合适的种子细胞，为临床解决骨缺损提供实验依据。' a  W- [5 W  S- \! D- K
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　　1材料与方法9 v1 O0 g( z0 Z! @- s5 d7 f

　　1.1取材0 s( j6 P5 u( d+ F
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　　取4周龄新西兰大白兔1只,氯胺酮(60～70 mg/kg)肌肉注射麻醉。严格无菌条件下自双股骨大转子部和骨髓腔，用骨髓穿刺针和20 ml注射器抽取骨髓4～5 ml,注射器内含5 ml肝素(100 U/ml)。

　　1.2试剂与仪器+ j( y$ s- q. H
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　　淋巴细胞分离液(percoll，密度为1.073 g/ml，上海华美公司)，DMEM培养基(Gibco公司，美国)、肝素、抗坏血酸、地塞米松、甘油磷酸钠(Gibco公司，美国)、胰蛋白酶(sigma公司，美国)，小牛血清(杭州四季青公司)，多标记免疫分析系统(1420,WALLAC BLCTOR2)，离心机(Heraus，德国)，倒置显微镜(重光，重庆),Leica Microsystems Heidelberg (GmbH)。

　　1.3兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的分离和培养

　　将抽取的骨髓液1∶1稀释，采用3次梯度离心法，第1次用percoll分离取白环以上部分，再洗涤2次，重悬于DMEM培养基，内添加15%小牛血清，谷氨酰胺，以细胞数为3105/ml接种于T50培养瓶中。置于37℃、5% CO2、饱和湿度条件培养箱中培养。原代接种后48 h首次换液，以后隔日全量换液，每日于倒置显微镜下观察细胞的生长情况。待贴壁细胞近铺满瓶底时,0.5%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代培养。
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　　1.4成骨细胞定向诱导培养
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　　传至第3代的BMSCs，在原培养基加入地塞米松108/mol，β甘油磷酸钠10 mmol/L，50 μg/ml抗坏血酸配置成成骨条件培养基，隔日换液。培养时间为3周。

　　1.5碱性磷酸酶(ALP)Gomori钙钴法染色

　　传至第3代的BMSCs接种在6孔板，加入成骨条件培养基培养3周后取出，冲洗，冷丙酮固定10 min，入孵育液中，37℃孵育4～6 h。2%硝酸钴浸5 min，冲洗1%硫化铵中2 min，干燥，封固。; D+ a; T, R& Y* ?- h1 U
1 K* }- t7 `) V! |
　　1.6矿化结节VonKossa改良法染色

　　传至第3代的BMSCs接种在6孔板，加入成骨条件培养基培养3周后取出，冲洗，95%乙醇固定10 min，2%硝酸银内置暗处1 h,蒸馏水冲洗后再流水冲10 min，还原1 h, 5%硫代硫酸钠1 h,干燥，封固。0 M3 E, a$ O) I, H9 ]

　　1.7四唑盐MTT法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线

　　选择第3代BMSCs，以密度为2104/ml平均接种于96孔板内，共48孔。分为2组，每组接种24孔细胞，A组用DMEM培养基，B组用成骨条件培养基培养。每24 h各取2组各3孔细胞。每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续孵育4 h，终止培养。小心吸弃孔内上清培养液，每孔再加入150 μlDMSO，打匀振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择540 nm波长，在酶免疫检测仪上测定各孔光吸收值，取其均值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制出BMSCs生长曲线。7 `+ M# n: U3 Z8 z5 }: G3 I; S

　　1.8激光共聚焦显微镜观察$ f' o  n7 O+ h  J! e( q

　　传至第3代的BMSC接种在6孔板，加入成骨条件培养基培养3周后取出，冲洗。1%Rhodamine溶液中染色5 min,洗涤3次，在激光共聚焦显微镜下观察成骨细胞。/ i/ z6 d1 k2 J6 {* A5 N/ m' ~

　　1.9统计学分析
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　　所得数据用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，2组比较采用t检验，P

　　2结果: H/ }: l1 r% i) A# c8 c& |* p
- p- s0 g7 _; n2 m0 M
　　2.1倒置显微镜观察
) _& {' p% l4 X  |0 ?4 l  d
　　接种后24 h的骨髓细胞悬液虽然经3步离心，但仍存有一些漂浮不贴壁的血细胞，并大量增殖。它们随换液可逐步清除掉，在漂浮不贴壁的血细胞下面可观察到少量骨髓内大的单个核细胞逐步贴壁、伸展，呈成纤维样细胞外观，即为BMSCs。培养48 h第1次换液后，去掉了大量的漂浮不贴壁的血细胞，见少量的BMSCs已经充分伸展长梭形细胞。培养76 h见BMSCs细胞开始分裂增殖，数量明显增多。7 d 后细胞进一步增殖，见胞核浆分界清晰，一般胞核位于中央，单核仁居多。胞体透亮，折光性强表示细胞状态良好，以长梭形为主，相互靠近形成集落早期。14～18 d后细胞大量增殖，以集落方式生长并相互连接成片，可进行传代。单层细胞以0.25% 胰酶消化传代，刚传代接种的BMSCs呈圆形漂浮在培养液中，1～4 h后能重新贴壁、伸展、增殖。2～3代约7 d传代一次，4代以后没3～5 d就可传代(图1)。

　　2.2长时间成骨诱导使细胞形态发生改变，细胞变大，出现扁平无规则细胞堆积, 细胞变为矮方形，短胖梭形(图2)。本实验观察到未加入条件培养基的BMSCs，当细胞爬满后，如不进行传代，细胞将整片的脱落下来，进而死亡；在加入条件培养基的BMSCs，细胞是以单个细胞的形式脱落，即使培养30 d，仍有大量诱导成功的成骨细胞贴壁生长。* Z" [/ i! ~& W7 C0 t4 t. u4 P/ E

　　2.3碱性磷酸酶染色

　　细胞Gomori钙钴法染色后，胞质中可见灰黑色小颗粒或块壮沉淀，深浅不一，随机计数十张盖玻片，阳性率90%左右(图3)。% U3 V, x# Z8 Z  ]8 u
: V) b; d: ~3 s
　　2.4矿化结节VonKossa改良法染色
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　　细胞VonKossa改良法染色为黑色结节，类圆形或方形(图4)。' w7 G/ k8 H% v, z/ n

　　2.5MTT法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线

　　2组生长曲线近似倒‘S’形(图5)，在传代后第1天细胞活性稍减少，经过2～3 d的潜伏期后进入对数生长期，约在第7天到达平台期。到第8天细胞出现生长抑制。B组细胞比A组细胞增殖要慢，差异有统计学意义(P

　　2.6激光共聚焦显微镜观察& F2 _# k/ z9 c& p/ `
0 P4 m9 \/ _5 w) u# H, k3 N
　　成骨细胞用rhodamine标记，成骨细胞鬼笔环肽显示骨架Factin为红色荧光(图6)。

　　3讨论2 V9 ?! C( y: x1 x- U5 t3 a
3 E! S) f- @4 Y& n7 p- x: o
　　骨组织工程的种子细胞应满足以下要求：(1)具有成骨潜能；(2)易于分离培养，体外增殖快；(3)经连续传代仍具有稳定的成骨潜能；(4)来源广泛，取材方便，对机体损伤小。骨髓成骨能力来源于骨髓基质细胞中的成纤维细胞集落形成单位。它具有多向分化潜能，可分化成骨系细胞。在诱导条件下可使其向成骨细胞系分化，表现成骨潜能［1］。/ a, T* H1 E; ?8 f

　　骨髓基质干细胞体外培养有如贴壁分离筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法［2］。密度梯度离心法离心法是将骨髓组织用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心,以去除血细胞成分。尽管使用了密度梯度法，并离心洗涤3次仍存在大量造血系细胞。但这些细胞由于大部分不能贴壁,所以可随换液而去除。本实验中发现，在原代培养的时候，这些残留的血细胞漂浮不贴壁，增殖很快，和贴壁的BMSCs细胞竞争培养液中的养分。故第1次换液最佳时间是接种后48 h。因而认为密度梯度离心分离方法是分离BMSCs比较理想的一种方法。  F# n5 G  l/ X; I; U# S7 P1 N2 e0 u

　　胞和内皮细胞等。Aubin［4］发现骨髓基质细胞中存在两种类型的骨祖细胞：定向骨祖细胞和诱导型骨祖细胞。前者不需要外源性诱导物能自动分化为成骨细胞,后者需在定向诱导下才能分化为成骨细胞。因而寻找合适的培养条件促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化，并加速其增殖已成为关键。培养液加入β甘油磷酸钠、地塞米松和抗坏血酸是间充质干细胞向成骨细胞分化的必需条件，也是成骨细胞体外成骨的重要条件。地塞米松的存在不仅促进骨髓基质细胞生长和分化,而且调节成骨细胞分泌胰岛素样生长因子,促进细胞外基质胶原合成［5，6］。抗坏血酸的作用是有助于细胞外基质的沉积［7］。Coelho等［8］研究认为β甘油磷酸钠可引导成骨细胞成骨，提高磷酸钙的沉积，其作用机制是β磷酸钠在培养液中迅速被ALP水解，产生大量的磷酸粒子，为成骨细胞的矿化沉积提供条件。只有在β甘油磷酸钠存在时,骨髓基质细胞才发生矿化结节的沉积。本试验在体外上述3种条件培养下，成功应用矿化结节VonKossa改良法染色观察到类圆形或方形黑色结节，说明诱导为成骨细胞。0 {: y5 p/ R+ n" G- o" M

　　激光共聚焦显微镜(Laser Scan Confocal Microscope，LSCM)［9］是20世纪80年代发展起来的高科技新产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图象处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象。不但能揭示细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数，而且可以给人以三维立体的概念。LSCM在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等)，而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是LSCM最大的优势。本研究用rhodamine标记成骨细胞，在LSCM下成功的观察到成骨细胞内显现出红色荧光内标记的鬼笔环肽骨架Factin。本实验在应用LSCM在BMSCs细胞诱导为成骨细胞的研究中做了初步的探索。
      【参考文献】
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　　4  Aubin JE.Osteoprogenitor cell frequency in rat bone marrow stromal population:role for heterotypic cell interaction in osteoblast differentiation.J Cell Biochem,1999，72:396398.

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　　6  何悦,张志愿,蒋欣泉，等.犬骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究.口腔颌面外科杂志，2006，3：209214.  p" @6 A4 D# u, u
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　　7  Allampall K.Effect of ascorbic acid and growth factors on collagen metabolism of flexor vetinaculum cells from in dividuals withand without carpal tunnel syndrome.J Occup Environ Med,2000,42:251255.4 c5 v0 y) x7 H7 Q6 E
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　　8  Coelho MJ,Trigon Cabral A, Fernandes MH, et al. Human bone cell cultures in biocompatibility testing. Part 1:Osteoblastic differentiation of serially passaged human bone marrow cells cultured in aMEM and in DMEM.Biomaterials,2000,21:10871094.* L- S+ |" U' Q

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　　9  Malone MH, Sciaky N, Stalheim L，et al.Laserscanning velocimetry: a confocal microscopy method for quantitative measurement of cardiovascular performance in zebrafish embryos and larvae. BMC Biotechnol，2007，7:40.

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