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作者：胡声锁，胡蕴玉*，魏义勇，彭华志作者单位：第四军医大学西京医院全军骨科研究所，西安 710032 . I# ^) R0 H* l7 k
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【摘要】 目的］比较不同浓度的血清，在转化生长因子β1（TGFβ1）存在的条件下，对脂肪成体干细胞（adiposederived adult stem cells，ADASCs）向软骨细胞分化的影响，探讨较为合适的血清浓度。［方法］取成年新西兰兔颈部脂肪组织，剪碎后通过Ⅰ型胶原酶消化，得到脂肪成体干细胞；稳定传代后，分别用含1％FBS和10％FBS的软骨诱导液干预ADASCs 2周，采用MTT检测方法对细胞增殖活性进行比较，应用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色进行软骨细胞鉴定，利用Leica病理图像软件分析两组间Ⅱ型胶原免疫组化染色后的灰度，比较两组细胞分化的效果。［结果］MTT检测显示10％FBS组细胞增殖活性高于1％FBS组（P＜0.05），两组细胞的甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性，并以10％FBS组更为显著；灰度分析提示10％FBS组Ⅱ型胶原表达量高于1％FBS组（P＜0.05）。［结论］体外研究表明，含10％FBS的软骨诱导液更有利于脂肪成体干细胞向软骨细胞方向增殖和分化，这将为作者采用这种新型的干细胞修复软骨缺损做好前期的准备。
/ l: N, y4 N( r) [ 【关键词】脂肪成体干细胞； 血清浓度； 软骨细胞+ a2 K2 q) S: S, t- J
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关节软骨损伤后的修复和重建是骨科面临的难题之一，迄今尚未得到很好的解决。传统的治疗方法如软骨下钻孔、磨削、微骨折等均存在一定的缺陷，但软骨组织工程技术的发展为解决这一难题带来了新的契机。组织工程中，种子细胞的来源是其首要和基本因素。常用的种子细胞是未分化的前体细胞或称为干细胞。最近，一种新的干细胞——脂肪成体干细胞（adiposederived adult stem cells，ADASCs）已被人们从脂肪组织中提取出来。研究证明，脂肪成体干细胞具有体外扩增能力强、衰老较缓慢及多向分化的潜能〔1～6〕。目前对于脂肪成体干细胞向成骨细胞分化的研究较多，但是向软骨细胞分化的研究则相对较少。其原因在于脂肪成体干细胞向软骨细胞分化中存在许多不确定的因素，包括TGFβ1、血清、胰岛素等的浓度以及诱导培养的方法等。为此，作者在前期研究即TGFβ1为10 ng／ml的基础上〔7〕，探讨血清浓度对脂肪成体干细胞向软骨细胞增殖分化的影响，从而为这种新型干细胞更好修复软骨缺损的深入一步研究提供实验依据和参考。. w# C, d( O+ X! i
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. t5 x, Y( j e4 y) l: n 1材料与方法
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1.1材料1 W" J0 S" o1 f) j# ?4 F
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/ [/ ]2 A( g& P$ j- r6 R 4个月龄新西兰大白兔（第四军医大学实验动物中心提供），重组人转化生长因子β1（PeproTech），胰岛素（Sigma），高糖DMEM培养基（Gibco），标准胎牛血清（杭州四季青），Ⅰ型胶原酶（Sigma），胰蛋白酶（Sigma），MTT试剂（Sigma），Ⅱ型胶原抗体（武汉博士德公司），24孔及96孔培养板（Costar），Leica病理图像分析系统（德国）。1 U! E8 D! P& t
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. L! |+ U2 F, X' z1 s& X/ ~ 1.2方法& q1 t7 y4 p) R+ ]
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1.2.1脂肪成体干细胞的分离及原代培养〔7〕6 M( R6 w! v% w! x( {4 r2 q
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取4个月龄新西兰白兔，体重约2.5 kg，雌雄不限，速眠新0.5 ml麻醉后，无菌条件下切取颈部脂肪组织，清除肉眼可见的小血管、包膜及结缔组织，PBS清洗3次以去除红细胞，剪碎后在含10％FBS的DMEM中1 000 r／min离心5 min，弃去上清液，加入2倍体积0.2%Ⅰ型胶原酶，37 ℃消化60 min后，加入等体积含10％FBS的DMEM中和，200目筛网过滤，1 000 r／min离心10 min，去上清后，加入含10％FBS的DMEM悬浮细胞，接种于25 cm2底面积培养瓶中，然后置于培养箱中，37 ℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。3 d后首次换液，弃除未贴壁的细胞，以后每2～3 d换液1次。当细胞生长至融合时传代，用2.5 g／L的胰蛋白酶／1 mmol/L EDTA于37 ℃消化细胞1～2 min后，1 000 r／min离心10 min，细胞稀释3倍转至培养瓶中培养，2～3 d换液1次，传至第3代。
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; l3 ]& j& j! L; M/ i 1.2.2脂肪成体干细胞向软骨细胞方向诱导分化1 c! c# ~7 E9 R; n
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取生长旺盛的第3代细胞，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，以5103／ml细胞密度接种于96孔板内，每孔体积200 μl；以3104／ml细胞密度接种于预先放置盖玻片的24孔板内，每孔体积1 ml，常规培养24 h后，更换无血清培养液再继续培养24 h，然后吸去无血清培养液，分别加入含两种浓度血清的诱导培养基诱导：（1）1％血清组：含FBS 10 ml／L、TGFβ1 10 ng／ml、胰岛素6.25 μg／ml、维生素C 50 μg／ml、青霉素100 U／ml、链霉素100 U／ml;（2）10％血清组：含FBS 100 ml／L、TGFβ1 10 ng／ml、胰岛素 6.25 μg／ml、维生素C 50 mg／ml、青霉素100 U／ml、链霉素100 U／ml。每3 d换液1次，均诱导2周。% g* c+ p6 J5 W% N3 G( u' }
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1.2.3MTT检测细胞增殖活性/ z1 o2 W& s7 _. s6 I: @
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. k& B g9 _% q- F 取96孔板培养细胞，每组3孔，分别于诱导后第3、7、14 d，每孔加入MTT溶液（5 mg／ml）20 μl，在37 ℃，5％ CO2孵箱继续孵育4 h，小心弃去孔内上清，加入DMSO 150 μl，振荡10 min，选择492 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值（OD）。
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0 \; f/ B0 b% [ `' H: I9 p$ a 1.2.4甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色3 j* u. T% b( z2 U
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取24孔板内的细胞爬片，于诱导后第14 d，行甲苯胺蓝染色，并按Ⅱ型胶原免疫组化染色试剂盒说明进行Ⅱ型胶原免疫组化染色。用Leica病理成像系统录入Ⅱ型胶原免疫组化染色后的细胞图像，进行灰度值分析。& j6 P. s# P/ i5 t& W
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1.2.5统计学处理1 m/ N, U. f) m9 Z' }4 r
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采用SPSS 13.0软件行两样本t检验，分析比较两组光吸收值的差异及Ⅱ型胶原免疫组化染色的灰度值差异。# g+ l- b" j* N, y# Y
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7 V$ |" ~8 f2 ~: W1 Y! X' A 2结果
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! i+ z5 n. T" O- H: `# y" r 2.1脂肪成体干细胞形态学观察2 K( L: l1 p0 n* a
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8 N3 s" J5 e" I9 A! u5 h- U5 s# r 原代培养的细胞于24 h内贴壁，贴壁细胞胞浆突起，初期为短梭形或小多角形，单核，细胞体积较小，呈集落或分散生长，以后细胞逐渐变为长梭形或多角形，呈类成纤维细胞样；贴壁后的细胞增殖速度较快，多个集落互相连接并逐渐融合，7 d左右可长满瓶底。传代后细胞突起减少，多呈长梭形或三角形，漩涡状生长，4～5 d可长满（图1）。
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) B7 u- k4 ?9 H2 ^# g% z 2.2细胞增殖活性
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MTT比色法显示在诱导后第3、7、14 d，10鸖组OD值均显著高于1% FBS组（P＜0.05），表明10% FBS组的细胞具有较好的增殖活性（图2）。8 E" w. F8 {( v$ j: j: p3 P8 {4 \* @
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5 P/ H. {# Z- I% g# W 2.3甲苯胺蓝染色* U+ B' N: E7 y6 t, M& p
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' E1 O2 H1 `+ } 两组细胞甲苯胺蓝染色均呈阳性，10% FBS组的阳性染色程度较高（图3）。5 [) d! k9 d( Z- I
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2 K, c4 z1 |+ U* ^& Y- k 2.4Ⅱ型胶原免疫组化染色
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/ `/ J/ G+ r( x Ⅱ型胶原免疫组化染色见两组细胞外基质的Ⅱ型胶原表达均呈棕黄色阳性（图4）。
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! A _$ X/ j: ^' b2 ?# O+ g) V% W 2.5Ⅱ型胶原灰度值分析结果
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Leica病理成像系统分析两组细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色后的灰度值结果见表1所示。采用SPSS 13.0软件行两样本t检验，提示两组间有显著性差异（t=-13.306,P＜0.05）。6 g. a% ]3 P; g5 p1 f
% o9 A4 ?3 D' E: U 表12组细胞Ⅱ型胶原灰度值分析结果（略）
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8 h& x" M ~0 P8 f1 q( H; u 3讨论
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! E5 o' S0 ?9 J/ r U6 } 组织工程软骨构建的首要条件是能获得足够数量的种子细胞，理想的种子细胞应具有易扩增、无免疫排斥及向所替代组织分化的潜能。由于成熟的软骨细胞来源有限，体外增殖能力弱，且表型稳定性差，难以满足组织构建的需要。因此，干细胞成为组织工程研究的热点。干细胞按照来源分为胚胎干细胞和成体干细胞，两者均有强大的自我更新能力及多向分化潜能，但胚胎干细胞由于涉及伦理道德问题使其应用受到限制。因此，成体干细胞是目前组织工程中最重要的种子细胞来源。长期以来，骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）一直是组织工程研究中首选的种子细胞。然而，BMSCs在应用过程中也发现一些问题〔8〕，学者们为了更好的研究种子细胞，在多方面进行了更广泛的探索。/ e+ C! }' e) y: Z' T4 _0 A8 w
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: v5 Q+ h8 g+ c P% R/ n+ R 新近发现的脂肪成体干细胞（ADASCs）是一种来源于脂肪组织的间充质干细胞，目前的研究已证实其具有与BMSCs类似的多向分化潜能。与BMSCs相比，ADASCs组织来源数量更为充足，少量的脂肪组织便可获取大量的成体干细胞，并不会因为年龄的增加而导致脂肪组织中干细胞数目的减少〔9〕，且其培养条件更为简单，分化表型可长期维持，衰老较为缓慢。同时，抽吸脂肪对患者的损伤较小，与抽取骨髓相比，患者更易接受。因此，ADASCs是一种很有应用前景的组织工程种子细胞。
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干细胞向特定细胞分化的过程中，要经历增殖和分化两个阶段。一般认为，这两个阶段是一个动态平衡的过程。细胞在分化的过程中，其增殖的速度将逐渐减慢，因此良好的增殖将有利于更多的干细胞向所需要的细胞分化。TGFβ1具有促进原始的间充质细胞向软骨细胞分化的作用〔10〕，它对细胞的增殖作用较小。作为细胞培养中常用的添加成分，血清的重要性是不言而喻的。研究已经证明，血清浓度不仅可以影响细胞的分化〔11〕，而且对细胞的增殖也具有重要的意义。由于血清中的复杂成分至今尚未完全清楚，其中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子，故而合适的血清浓度对于体外培养细胞的增殖和分化是非常重要的。因此，本实验对比了在TGFβ1为10 ng／ml的情况下，血清浓度对脂肪成体干细胞向软骨细胞分化的影响。通过作者的实验研究可以看出，MTT检测结果显示10％血清较1％血清更能促进细胞的增殖，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色灰度分析则表明10％血清具有更好的促进ADASCs向软骨细胞分化的作用。因此，作者认为含10％浓度胎牛血清的软骨诱导液对于ADASCs的增殖和分化效果更好。由于不同来源、不同批次的血清质量变化较大，可能会造成实验结果的数值不尽相同，本研究的目的是为了说明血清浓度在诱导细胞增殖和分化两方面的影响，在此基础上，作者将进一步探讨其他可能影响ADASCs向软骨细胞增殖、分化的因素，提供使用这种新型干细胞作为种子细胞的较成熟的经验。; O/ |7 {# n) o, E. c1 B
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（本文附图见加页4）（略）6 l# s% P; @* m
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发表于 2009-3-3 12:32
发表于 2015-5-24 14:07
