求神经干细胞神经球的nestin免疫荧光染色方法？

lymphj198511

为了不让辛辛苦苦培养成的神经球浪费了，想咨询一下高手们的具体染色过程和注意事项。谢谢了

jhu132llh

1.用PBS洗去培养液，注意小心丢失细胞6 n3 V6 e7 r4 {) x
2.固定液固定20-30分钟，可用甲醇和丙酮固定液，也可以用2%-4%的多聚甲醛固定液，当然了还有很多的固定液效果也挺好的0 U! R) G  F/ P) ?6 D
3.用PBS洗去残留固定液
& b& z! N* x6 f4 {$ I9 k4.用10%封闭血清封闭30分钟-1小时8 |1 Q  w5 G, {* [
5.上一抗，4度过夜。注意一抗的抗体稀释液和一抗的抗体稀释浓度
2 L4 C, X1 r( |4 Q7 Q0 Y6.洗涤+ a- s, {7 A6 V- t/ u# J! T
7.上二抗，注意稀释比例，室温30分钟-1小时
" p$ _& o' ?  f4 [% M( E' |& a8，洗涤
- r8 U1 {/ _8 I* O  q5 v$ S" ]+ Z9.染核2 r/ L& D5 W' I
10洗涤3 b4 ?; l8 p2 t. c9 w$ F
11.检测并拍照5 [% H! c( T$ B. K  ?# B
PS：染核有时候不做

lymphj198511

谢谢

wudai

都是悬浮细胞，是不是要用多聚赖氨酸包被的玻片让他们粘附啊

zhaonicholas

回复 2# jhu132llh
7 G& c: b+ n" @1 n2 y# A/ W# _请问这个染色过程也是要先让细胞爬片吗？谢谢

jhu132llh

要是悬浮细胞的话9 c: L9 u; X2 ?
是需要吧细胞悬液在多聚赖氨酸处理过的玻片上10-20分钟使其贴附的，最好能让细胞在玻片的一定范围内，利于观察) J/ t7 e- ]1 {2 I
还有细胞数有点要求3 z4 g- `' p$ k* O
安我们的经验，一般一张片子上贴附的细胞数不超过10*5个吧

jhu132llh

回复 5# zhaonicholas
) Z: t. G1 q. ^; _" G6 c$ o7 v! H
4 N* t2 l2 p0 c
& u2 f& h* q, v$ h- Q& B+ ~    是的) J  H2 o( V3 j: P7 E
前提是你的细胞能爬上去
& j) |8 `# k) v" z若是悬浮细胞的话0 _: d9 F* V3 ]6 Q) f# B" S
估计得手动吧细胞悬液滴在多聚赖氨酸处理过的玻片上了

平平淡淡

怎么固定后就封闭了？不用透化吗？

碧海丹心石

本人是用的 poly-L-lysine/laminin 分别在盖玻片上包被两个小时，然后加入神经干细胞培养的，一般两个小时就可以完全贴壁了，你可以试下
# C# _7 e6 B# p3 |. j( v还有，免疫荧光要透化30mim，然后再封闭

bin

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" S5 O9 s4 S1 n7 i% V: U, q
4 w  f2 g! i' F: f4 W( W1 ~请问一下，这样贴壁在以后洗的步骤中会不会掉下来，我看了血涂片的制作，我在想可不可以按照那样的方法来使其贴壁。