求神经干细胞神经球的nestin免疫荧光染色方法？

lymphj198511

为了不让辛辛苦苦培养成的神经球浪费了，想咨询一下高手们的具体染色过程和注意事项。谢谢了

jhu132llh

1.用PBS洗去培养液，注意小心丢失细胞+ Q* `% t8 w$ }
2.固定液固定20-30分钟，可用甲醇和丙酮固定液，也可以用2%-4%的多聚甲醛固定液，当然了还有很多的固定液效果也挺好的
8 F  ^+ r6 d9 U! U1 {6 N, N# Z( B3.用PBS洗去残留固定液
- c" A6 i" }3 M# P4.用10%封闭血清封闭30分钟-1小时
; y' X& C9 a) E8 U% S1 m5.上一抗，4度过夜。注意一抗的抗体稀释液和一抗的抗体稀释浓度
' d+ B( N# q- a6.洗涤5 R9 d/ Q* |' u
7.上二抗，注意稀释比例，室温30分钟-1小时) j5 {: {0 f4 {: L# Q" T5 M& _
8，洗涤6 o4 T8 u7 {* s" t' Y/ i
9.染核- I1 x7 E* q: v: B/ b# p
10洗涤/ J  E; [! f$ ^! ]0 E' s& G
11.检测并拍照( n- d4 Q8 G; P$ z2 `- b9 t# w& V
PS：染核有时候不做

lymphj198511

谢谢

wudai

都是悬浮细胞，是不是要用多聚赖氨酸包被的玻片让他们粘附啊

zhaonicholas

回复 2# jhu132llh
2 `* }  r: I5 k4 W' ^4 T$ P: M请问这个染色过程也是要先让细胞爬片吗？谢谢

jhu132llh

要是悬浮细胞的话( X, C# e$ p6 B& y7 X7 u7 Y
是需要吧细胞悬液在多聚赖氨酸处理过的玻片上10-20分钟使其贴附的，最好能让细胞在玻片的一定范围内，利于观察' ]+ Q% Z; i. v4 x$ W
还有细胞数有点要求
2 P& n7 l( n7 B8 e1 r, C+ m安我们的经验，一般一张片子上贴附的细胞数不超过10*5个吧

jhu132llh

回复 5# zhaonicholas
( S, B' p) r! E' f# d$ Z6 f
; e+ S- @9 A, U# ~. `, ^; N1 t* t$ T$ B$ Y1 o1 S! |; [, S
    是的
& z( ^& @4 m6 t/ e" A0 s2 S4 o前提是你的细胞能爬上去) {6 ]9 @, q) `: W
若是悬浮细胞的话/ u! c1 b8 ]' T; M0 j" ?7 K. V
估计得手动吧细胞悬液滴在多聚赖氨酸处理过的玻片上了

平平淡淡

怎么固定后就封闭了？不用透化吗？

碧海丹心石

本人是用的 poly-L-lysine/laminin 分别在盖玻片上包被两个小时，然后加入神经干细胞培养的，一般两个小时就可以完全贴壁了，你可以试下: d  _+ i: j# S
还有，免疫荧光要透化30mim，然后再封闭

bin

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9 J5 [& w, \: A# c1 ]7 \; `: j; v
' O$ I! G" e& m0 ^. J1 C& O请问一下，这样贴壁在以后洗的步骤中会不会掉下来，我看了血涂片的制作，我在想可不可以按照那样的方法来使其贴壁。