求神经干细胞神经球的nestin免疫荧光染色方法？

lymphj198511

为了不让辛辛苦苦培养成的神经球浪费了，想咨询一下高手们的具体染色过程和注意事项。谢谢了

jhu132llh

1.用PBS洗去培养液，注意小心丢失细胞5 s) `$ u, h, w7 D! @  c
2.固定液固定20-30分钟，可用甲醇和丙酮固定液，也可以用2%-4%的多聚甲醛固定液，当然了还有很多的固定液效果也挺好的
" t( y& d4 `8 y; G/ |; P8 w9 b2 R0 L3.用PBS洗去残留固定液
6 J( S# Z- `. d$ I' y6 }4.用10%封闭血清封闭30分钟-1小时, s! U5 U( t# F8 Y; L  u' p$ }( C
5.上一抗，4度过夜。注意一抗的抗体稀释液和一抗的抗体稀释浓度, e& G) O8 c+ {7 s! ^
6.洗涤
' x; D& R6 d( T: n& r7.上二抗，注意稀释比例，室温30分钟-1小时
0 @/ F$ B& J* ^7 M) ]' q8，洗涤
: k; ]4 ?2 n6 h1 r7 b. Q. r9.染核" t. p) \4 b5 F
10洗涤
. Y1 x6 Z  V1 _* w* ?) z+ |11.检测并拍照
4 W2 K: z4 H# I" vPS：染核有时候不做

lymphj198511

谢谢

wudai

都是悬浮细胞，是不是要用多聚赖氨酸包被的玻片让他们粘附啊

zhaonicholas

回复 2# jhu132llh $ _' _3 f7 a% z- p
请问这个染色过程也是要先让细胞爬片吗？谢谢

jhu132llh

要是悬浮细胞的话; T9 t" s! e5 T+ k) X7 D
是需要吧细胞悬液在多聚赖氨酸处理过的玻片上10-20分钟使其贴附的，最好能让细胞在玻片的一定范围内，利于观察
4 ?. [! Y0 q- B* ^, x$ ]还有细胞数有点要求. _4 G! m- e7 q' r7 |* i/ j3 y
安我们的经验，一般一张片子上贴附的细胞数不超过10*5个吧

jhu132llh

回复 5# zhaonicholas # v3 X  c6 {* X- j- i9 M: X

; G! e( I% m: Z" a& s! m" r) k2 ~" d
, j4 U; y. G7 S5 @" K    是的
; L& @: R- c( U0 M前提是你的细胞能爬上去
6 r. m# q& _! `9 W若是悬浮细胞的话! Y" i9 _* F6 f4 v5 S! g2 a* z9 p
估计得手动吧细胞悬液滴在多聚赖氨酸处理过的玻片上了

平平淡淡

怎么固定后就封闭了？不用透化吗？

碧海丹心石

本人是用的 poly-L-lysine/laminin 分别在盖玻片上包被两个小时，然后加入神经干细胞培养的，一般两个小时就可以完全贴壁了，你可以试下
: L! `- |+ S* ~; Z! z! y还有，免疫荧光要透化30mim，然后再封闭

bin

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$ q" L! {0 g% m5 l& Z% S* h
7 O" ?; P9 o7 M; Y2 t请问一下，这样贴壁在以后洗的步骤中会不会掉下来，我看了血涂片的制作，我在想可不可以按照那样的方法来使其贴壁。