免疫组化基本步骤

xiaocuicui

免疫组化

wstl1986

很有用

aulenuyah

和回答的同志们

aulenuyah

谢谢楼主

syl1982

免疫组织化学染色 ) J8 n1 h6 U+ `6 a
SP法： . Z1 m; E3 C2 X6 w8 F
脱蜡、水化： ( r/ Y1 J( c6 v' w7 t  p
脱蜡前，应将切片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
" F5 L* i. M; H: t& g# e, m# e切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
* X- M# N+ X' Q! v' G& C+ Y  b, \无水乙醇中浸泡5分钟； 4 e9 G+ K$ v% I  S4 k; p, c* e! d
95%乙醇中浸泡5分钟；
3 d; M" o) i7 Z70%乙醇中浸泡5分钟； * G( r4 S& o0 [8 K* ~* Y  d. t! |
PBS洗2～3次各5分钟； . s* x% k6 a3 N$ T2 Z
3%H2O2（80%甲醇）滴加在切片上，室温静置10分钟；
1 X4 k) o( y# Z1 G' r( ^# fPBS洗2～3次各5分钟；
  J5 r9 W. m! h0 n  g抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） + V+ r% @+ Y! F8 j) ]
抗原热修复 6 n# O0 w6 Q$ B
高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
* A* _; |/ V  a煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入切片加热10~15分钟。
9 x8 m: t4 M" k" S" m5 v1 }( a微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将切片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 " Z- H& C. i* O) I! y. [
酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
+ @7 l8 ]9 D/ t# wPBS洗2～3次各5分钟； # b1 \, F6 r: ]! a/ D: r
滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
( G8 ^% ^5 I' r滴加一抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 ; Q: S% u) {" V0 ^
4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
0 h' ?: D2 \. d0 NPBS洗3次各5分钟； : f+ D8 O4 v8 ^( J
滴加二抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时； 2 M- v  A, s# ?
二抗中可加入0.05%的tween-20；
! \& s! G% u; Z' c" g, EPBS洗3次各5分钟； + W- k; j: s9 b- ]7 X" ]8 c1 K
DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； * t' ^7 u$ \: y
PBS或自来水冲洗10分钟； ! T( B# l$ k" E: o/ j
苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化； 8 h9 y) y' c9 i/ p8 o5 {; J
自来水冲洗10～15分钟； ) A: V, _# c! \2 ^; W3 |1 s
脱水、透明、封片、镜检。 5 |3 U  ]* @9 r" Y5 v( z2 M9 n
SABC法: ( A: D- X: x1 R/ ^' `7 a' i
脱蜡、水化；
' Y: [) b0 I) B4 M- Q8 i1 c8 n2 `PBS洗两次各5分钟；
" b! b% G0 f! q, Q: x用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次；
  P4 _1 @, a* K抗原修复； ' m! n2 H7 y4 a, k. z
PBS洗5分钟；
7 s# d* Q0 u, p6 M/ W8 O2 }7 J滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体；
* m& F  r; I) H0 M) g滴加一抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟） / C, B/ B' e$ z- L7 J6 L
PBS洗三次每次2分钟； - H6 ^! r" k, R* X
滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟； : I  c1 P" m9 s  Z5 d
PBC洗3次每次2分钟；
& Z' v" J: ~/ Y$ W. [滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟； , }2 K! g% b& K1 _8 u
PBS洗4次每次5分钟； , Z6 a  K& ?! L. E( M% n
DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）；
: I7 _' i- i# ?& s  X蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化； ( l, d5 z$ c! b! R4 I7 I1 w3 Z
脱水、透明、封片、镜检。
4 c- W) r" A0 w& r

421087176

谢谢

xiaocuicui

真的很有帮助

seventhcat

受益匪浅，谢谢

stemcellfamily

1、载玻片的处理：
$ o2 ^8 H, }9 W& g& C0 @; Z抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：% [& t; \% o) ^3 u6 v8 Q. i
1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。' @! ^) \' D7 ]" [! T
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
+ b: k$ H" \$ c- _1 L( R1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
, y5 K  S: ~, Q/ v: J. R3 H! H/ R, t2、常用酶消化：
( @" L0 j) p( F2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。) n& N9 M* g& u5 L0 Q
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
% j2 W+ ^) `& W+ Y- t. }( `) U  2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。) x" J# _7 C3 D9 F0 |
3、抗原热修复：2 k# P0 i7 w; h+ D& _% ~
   可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0  0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。' R8 y+ I) w# a9 d1 Z* m% A
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。/ g3 e$ M6 X0 o2 M; |2 c
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。+ ^( ]1 b; a  k6 P9 R' z2 `
  3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。8 \" }! j; z  V
4、免疫组化染色步骤：- N+ J% u# ^" Q+ ]2 S  D% t
  （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）2 }3 g7 q( x: e( J
   石蜡切片脱蜡至水。6 [; z) S) [" T- M
   3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。2 n& Y& I: ?6 J) |3 u( ^  m
   蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。6 F) F& t- _2 j7 K
   5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
& H" r/ M' I0 I+ [& A1 H   PBS冲洗，5分钟×3次。- P+ {3 c9 s1 ^$ c  n* k
   滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。/ I+ {( b9 z2 a( |
   PBS冲洗，5分钟×3次。! I  ]. ^/ ^% |" z# u" t* V# r
   滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
+ E# x. U/ n1 m3 E$ L1 h# g5 ?" t   PBS冲洗，5分钟×3次。
0 n( u- W0 q3 q; k) Y! j$ O9 V   显色剂显色（DAB或AEC）。  A8 e0 J" D; \/ k  V. ^% P
   自来水充分冲洗，复染，封片。
, S4 ?; r8 t# ]  u) V  S; ^冰冻切片免疫组化染色步骤
7 R& q9 q" ~6 o. M! O冰冻切片4~8m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。8 C# g3 Y- O1 _6 X" S) T
下接免疫组化染色操作步骤。