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发表于 2009-3-3 12:33 |显示全部帖子 |倒序浏览 |打印

作者：苏沐，姜藻作者单位：东南大学附属中大医院肿瘤中心，江苏南京  210009 4 R6 w: e. f# C" p




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      【摘要】  目的：观察5氟尿嘧啶（5FU）对人结直肠癌细胞株SW480的作用与Musashi1基因表达变化的关系。方法：用MTT法检测不同时间5FU对SW480细胞增殖的影响，流式细胞术检测侧群（SP）细胞和CD34＋CD44＋细胞比例，RTPCR半定量检测Musashi1基因表达。结果：5FU作用于SW480细胞24、48、72 h的半数抑制率依次为32.12、16.2和6.8 mg·L－1，SP细胞比例、CD34＋CD44＋细胞以及Musashi1 mRNA表达在5FU作用后均增加。结论：正常肠道干细胞标记物Musashi1有可能成为结直肠癌干细胞样肿瘤细胞特异性标记，CD34、CD44可能具有类似的潜力。 8 k! F0 a' E$ j! `
      【关键词】结直肠癌细胞株SW480；Musashi1基因；肿瘤干细胞；5氟尿嘧啶6 _3 w4 n: j! D, o6 g
   　结直肠癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率有逐渐上升趋势。关于其发病机制存在众多假说，其中一种是“肿瘤干细胞假说”。该假说认为肿瘤中存在一小群具有干细胞功能的肿瘤细胞，被称为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs），这些CSCs的存在可能是肿瘤发生的根本原因，同时也可能是肿瘤耐药的重要原因以及复发或转移的起源。已有研究证实正常肠道中存在隐窝干细胞，同时还证实Musashi1是其特异性的标记物。本实验将结直肠癌常用的化疗药物5氟尿嘧啶（5FU）作用于结直肠癌细胞株SW480，主要观察Musashi1表达改变。

　　1材料和方法
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　　1.1材料人结直肠癌细胞株SW480（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心），RPMI 1640细胞培养基（GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），四甲基偶氮唑蓝（MTT）、Hoechst 33342 (Sigma公司)，Trizol裂解液、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒（TaKaRa公司）。光学显微镜，CO2恒温箱细胞培养，生物超净工作台，酶标仪，流式细胞分析（FCM）仪，PCR仪。% \& P, i4 E/ S$ [# B

　　1.2方法. b* @# W+ q% V( P  d: a. p7 a) U
3 q2 ~2 \" G# e/ f
　　1.2.1细胞培养与实验分组SW480细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5%的CO2 培养箱中，每2～3 d传代1次，实验时取对数生长期细胞。浓度为7.5、15、30 mg·L－1 的5FU处理48 h后的SW480细胞和对照组SW480细胞依次设为A、B、C及D组，浓度为7.5、15、30 mg·L－1 5FU处理24 h后的SW480细胞依次设为E、F、G组。

　　1.2.2MTT法计算抑制率将SW480细胞5104 ml－1 接种于96孔板，培养箱中孵育24 h后加入培养液稀释的5FU，5FU终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50及100 mg·L－1，每个浓度设5个平行孔。另设阴性对照组和空白调零孔。培养箱中分别孵育24、48 h后加入MTT孵育4 h，自动酶标仪上测定OD570值。抑制率=（1－实验组平均OD570值/对照组平均OD570值）100%。$ z% O0 J) t7 n9 d! B

　　1.2.3FCM仪检测侧群（side population,SP）细胞比例[1]A、B、C及D组细胞均分置于两管中，分别记为1、2管，800 r·min－1 离心5 min；两管中均加入Hoechst 33342及2%胎牛血清的RPMI 1640培养液，使Hoechst 33342的终浓度为5μg·ml－1；仅在2管内加入维拉帕米并使维拉帕米的终浓度为50μmol·L－1，37℃水浴90 min。置于4℃以备FCM仪检测SP细胞比例。SP细胞比例＝1管中Hoechstlo比例－2管中Hoechstlo比例（这是由于SP细胞具有外排Hoechst 33342的能力，而维拉帕米可以拮抗SP细胞该功能）。

　　1.2.4FCM仪检测细胞表面分子CD34及CD44的表达将A、B、C及D组细胞以800 r·min－1离心5 min，分别加入20μl CD34、CD44单克隆抗体（B﹠D公司）（4℃，30 min），冰PBS洗涤1次，在FCM上检测CD34＋CD44＋细胞比例。

　　1.2.5RTPCR半定量检测Musashi1Trizol法提取 A、B、C、E、F、G及D组细胞的RNA，琼脂糖凝胶电泳初步评价RNA质量、分光光度仪测定总RNA纯度。按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RTPCR操作，根据RNA纯度将每组的RNA调至每个反应体系中含1μg。Musashi1引物上游序列为5′GGCTTC GTCACTTACATGGACCAGGCG3′,下游引物序列为5′GGAAACTGGTAGGTG TAG3′，扩增产物为542 bp；内参为GAPDH，产物为216 bp。对RTPCR产物进行琼脂糖电泳，数字成像系统进行拍照分析。

　　1.3统计学处理计量资料以x-±s表示，应用SPSS 11.5统计软件，组间比较采用单因素方差分析(OneWay Anova)，P
) j+ f& N& {, }6 p/ C- R
　　2结果: t1 @" F4 G: ^! D, o

　　2.1不同浓度、不同作用时间的5FU对SW480细胞的抑制情况不同浓度 (3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·L－1) 5FU作用于SW480细胞24、48、72 h后细胞的生长抑制率见表1。由表1可见，5FU对SW480细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性，且不同时间组之间存在显著差异(P1 O, x7 i" X; {. H, E0 R% }

　　表15FU作用后SW480细胞的生长抑制率（略）
  `& T% y( a( O7 w
　　Tab 1Inhibitory rate of SW480 after dealing with 5FU for different time7 z& A4 h4 V2 }
( G, X) E& A' d2 n0 M4 l) c
　　2.25FU处理后SP细胞比例的变化5FU处理引起的SP细胞比例变化见图1（图中已圈出SP细胞所在区域）。" V6 V) z  M3 u

　　图15FU处理SW480细胞后SP细胞比例的变化（略）7 \- \# }. W& p% `& \( j
/ N. g( [9 R8 y& ?/ k4 `
　　Fig 1The proportion of SP cells with 5FU(15 mg·L－1) for 48 h
8 h: S, [' ]! I3 E! D2 f; w
: j- I4 U5 e, f
- _' }) F4 k6 b' F
　　D组(对照组)经Hoechst 33342染色后，Hoechstlo细胞比例为1.33%（图1A），经维拉帕米拮抗后再行Hoechst 33342染色，Hoechstlo细胞比例为0.69%（图1B），两者的差值即为SP细胞比例（0.64%）；B组直接行Hoechst 33342染色，Hoechstlo细胞比例为3.6%（图1C），加维拉帕米拮抗后Hoechstlo比例为0.02%（图1D），SP细胞比例为3.58%。显示5FU作用后SP细胞比例明显增加。
- J7 V% m  ]- Y) C9 W8 O' k
　　2.3不同浓度5FU处理后CD34＋CD44＋细胞比例的变化经不同浓度5FU处理后CD34＋CD44＋细胞比例的变化见表2。表2显示5FU作用后SW480细胞中CD34＋CD44＋细胞比例增加，且存在浓度相关性。) u  |6 S; j7 c& q$ k
1 d1 v: w9 H5 D3 e
　　表2不同浓度5FU处理后SW480细胞中CD34＋CD44＋细胞比例（略）! W- K  O4 f( j* X* D
+ I- X( i! H- C6 k$ X: V
　　Tab 2The proportion of CD34＋CD44＋ cells with 5FU on different concentration for 48 h% k" p4 U3 m& I! L) S' u
3 Q$ R9 G+ Z, h5 T' E
　　注：各实验组与对照组相比，均为P

　　2.4不同时间、不同浓度5FU处理后Musashi1 mRNA表达的变化% x$ V& g; I2 W5 M" ^
7 v' s5 Q9 V5 J( ^
　　图2为各组细胞RTPCR的电泳图。- `. m0 w# |1 B. q% W
! u. `/ q; K! p. q7 b! Q8 \
　　图25FU作用对Musashi1 mRNA表达的影响（略）

　　Fig 2The mRNA expression of Musashi1 with 5FU on different concentration for different time

　　在图像处理系统上分析得出Musashi1和GAPDH的光密度，以GAPDH的光密度为参照物,得到Musashi1 mRNA表达的半定量结果：随5FU浓度增加，Musashi1 mRNA表达有增加的趋势（P005)。

　　3讨论- h/ P' |4 c4 R2 W0 V. Q

　　肿瘤干细胞假说早在上个世纪就已经提出[2]。该假说认为：肿瘤组织与正常组织一样，是由处于各种分化等级的细胞组成。其中有一种在数量上占少数的干细胞样细胞，它具有无限增殖能力和分化潜能，是肿瘤形成的起始细胞，它能够通过分裂产生大量的增殖能力有限的其它肿瘤细胞以及增加自身细胞的数量，所以，它在肿瘤的发生、恶化、转移中起重要作用。有关该假说的研究进展一直缓慢。直到近几年，随着急性髓样白血病干细胞(acute leukemiainitiating cells)[3]、乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells)[4]、脑瘤干细胞(brain tumor stem cells)[5]以及慢性髓系白血病干细胞(chronic myeloid leukemia stem cell)[6]的相继发现，该假说又重新引起了研究人员的广泛关注。本实验采用了研究干细胞的经典实验方法，即SP细胞的识别。Goodell等[1]以荧光染料Hoechst 33342对小鼠骨髓细胞染色后用双波长的FCM仪进行分析，发现有一小群细胞并不能累积足够剂量染料，即为Hoechstlo细胞群。重要的是，造血干细胞在Hoechstlo细胞所占比例极高。基于该方法已在多种组织识别出被认可的干细胞，而目前得到公认的干细胞特异性标记物极少，该方法成为识别干细胞的一种重要的方法。将小鼠乳腺组织中SP细胞注入乳腺脂肪垫中，可产生完整的腺导管及腺小叶组织[7]。这一结果与乳腺癌干细胞特异性表面标记CD44＋CD24－[4]有异曲同工之妙。Potten等[8]对小鼠小肠组织进行研究，认为Musashi1可能是小鼠肠道上皮成体干细胞可靠的标记物。后有日本学者得出了类似结论[9]，认为Musashi1在小鼠小肠隐窝的柱状上皮细胞中表达，其可能成为小肠干细胞及早期前体细胞的标记物。Nishimura等[10]通过对155例正常的人结肠标本进行免疫组化分析后发现，Musashi1表达阳性的区域与肠道干细胞的位置一致，有理由认为Musashi1在结肠隐窝细胞的非对称分裂过程中起着重要的作用。Musashi1是一种进化保守的RNA结合蛋白，选择性地表达在神经前体细胞包括神经干细胞上，在维持神经前体细胞的干细胞状态、分化和肿瘤发生方面起着重要作用。早期对Musashi1的研究主要集中在中枢神经系统的分化、肿瘤形成等方面。有多项研究[11]证实，Musashi1与神经前体细胞的非对称分裂这一重要的干细胞特征有关；在哺乳动物体内还发现，Musashi1可以通过抑制mNumb mRNA转录后的翻译而增强Notch信号通路，从而有利于神经干细胞的自我更新。本实验发现5FU处理SW480的Musashi1 mRNA表达增加，且呈现一定的浓度依耐性。结肠癌细胞在受到化疗药物5FU作用后，是否通过Musashi1的表达增加进行肿瘤细胞群的自我更新，以抵御这一外来的损伤？同时在本实验中，5FU处理后的Musashi1 mRNA表达的改变同SP细胞的变化是一致的，是否可以进一步推论Musashi1是结直肠癌干细胞的可靠标记？这些疑问有待进一步实验的证实。CD34是造血前体细胞特异性表面标记，后有研究证实CD34在血管内皮细胞中有表达，渐被用于检测肿瘤转移时微血管密度。CD44是一普遍存在的涉及细胞与细胞、细胞与基质之间粘附作用的多功能的细胞表面粘附分子，尤其是CD44的变异体与肿瘤转移的关系特别密切，在结肠癌肝转移的研究中涉及较多。CD44也参与细胞凋亡，有研究证实[12]CD44具有选择性抗凋亡的作用，可以与其他抗凋亡机制共同作用于肿瘤细胞使之具有恶性表型。本实验中，SW480细胞经5FU处理后，CD44＋CD34＋细胞比例明显增加。这一结果与5FU作用后SP细胞比例明显增加是一致的，是否CD34及CD44分子的表达与SW480的SP表型有关？造血干细胞和乳腺癌干细胞都有其各自特异的表面CD（cluster of differentiation）分子的表达，是否结肠癌干细胞也有其特异性表达的CD分子？这些问题的解答有待进一步的研究。经临床常用于治疗结直肠癌的化疗药物5FU处理结直肠癌细胞SW480后，SP细胞、Musashi1 mRNA表达以及CD34＋CD44＋细胞呈现一致性的增加。Musashi1、CD34＋CD44＋有可能成为结直肠癌干细胞细胞特异性标记物。更为重要的是，其可能成为新的治疗靶点，为结肠癌治愈带来一线希望。: k- o$ {0 ?6 C

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