请问应该用哪种方法培养内皮祖细胞？

zoe

目前主流有三种培养方法：1. 接种后4天首次换液，保留贴壁细胞，弃不贴壁细胞；2. 接种后24小时首次换液，保留细胞，弃不贴壁细胞；3. 接种后48小时，弃贴壁细胞，收集未贴壁细胞重新接种。请问哪种方法比较好，请大家发表高见~~~

manybit

对于动物通常是这样做的：
" F  ^7 D8 J  g/ L# U# D+ g0 i! x按照手术操作规程切取犬颈外侧静脉3-5cm，PBS冲洗2-3遍，至冲洗液清亮后，向血管管腔内注入0.1%I型胶原酶2ml，37℃消化15-20min，收集消化液，1000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞，洗涤后计数，接种于直径60mm的培养皿，加入EGM-2培养液，置于37℃培养箱内进行培养，次日换液，以后每1-2日换液一次，待细胞长满后获取原代内皮细胞，并进行形态学观察。

manybit

对于动物通常是这样做的：8 \+ @& @: _5 R
按照手术操作规程切取犬颈外侧静脉3-5cm，PBS冲洗2-3遍，至冲洗液清亮后，向血管管腔内注入0.1%I型胶原酶2ml，37℃消化15-20min，收集消化液，1000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞，洗涤后计数，接种于直径60mm的培养皿，加入EGM-2培养液，置于37℃培养箱内进行培养，次日换液，以后每1-2日换液一次，待细胞长满后获取原代内皮细胞，并进行形态学观察。

zoe

谢谢manybit前辈的回复。那如果是需要养骨髓来源的内皮祖细胞，而不是内皮细胞呢，应该如何操作？

chinajinlei

9 l, U- G; S  Q0 w  Z& i8 z
# {. d1 R! s, S/ b7 n0 S; p这个问题问得很好，不同的培养方法得到的EPC可能属于不同的类型，如下图所示：9 y6 R- ?' \; K# r2 s" C& D1 a8 B: t
" N3 @( b. Y7 a: v6 r& O- `. Q/ ?
楼主感兴趣的话，不妨认真看一下参考文献。另外再找几篇高影响因子的期刊对比一下。看你实验需要的是哪一类EPC，然后确定实验方案。  o. B$ S3 X7 ^9 i
参考文献：
. a$ L7 J: @. A; X6 f7 H9 {. o, k[1]Prater, D. N., J. Case, D. A. Ingram and M. C. Yoder (2007). "Working hypothesis to redefine endothelial progenitor cells." Leukemia 21(6): 1141-1149( y1 x4 m7 n0 j0 \
[2]Avci-Adali, M., A. Paul, G. Ziemer and H. P. Wendel (2008). "New strategies for in vivo tissue engineering by mimicry of homing factors for self-endothelialisation of blood contacting materials." Biomaterials 29(29): 3936-3945

zoe

回复 chinajinlei 的帖子- L$ \9 W* x# w0 N

3 z9 f+ B; }3 M, h. l谢谢chinajinlei前辈的指点。但是EPC培养的三种方法，现在讨论的比较多的是外周血或脐血来源的，那么对于骨髓来源的也适用吗？比如选用24小时或4天前贴壁的细胞，养出来的细胞跟骨髓间充质干细胞有区别吗？如果选用48小时未贴壁细胞重新接种，我发现是可以看到细胞集落，可是这些细胞内吞ACLDL的能力不是很强，所以在怀疑究竟重新接种得到的是不是EPC。本人刚接触这种细胞，问的问题比较多，还请前辈谅解并不吝赐教。

chinajinlei

zoe 发表于 2010-12-1 12:07
; }/ z; @2 \4 [& J4 N/ W$ }回复 chinajinlei 的帖子4 M! T, f* Y' O5 r# D4 \, h
: r. U& f) g8 K! s; i/ G; F
谢谢chinajinlei前辈的指点。但是EPC培养的三种方法，现在讨论的比较多的是外周血 ...

4 \2 y/ f" l; D/ h我也是正在摸索，不必客气。% q" N4 @! y; G. f0 @6 }
目前我主要关注的是兔外周血来源的EPCs，关于骨髓来源的EPCs了解不多。对于骨髓来源的内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞间差别我也很是疑惑。还请熟悉这方面的大侠 多多参与讨论。
& K# x3 P5 N8 `
& B# w$ A. {9 d: `8 W6 x& W我曾在文献中看到过这么一段话，请参考“Adult bone marrow-derived LDL uptake-positive cells that have been reported so far actually are monocytes/macrophages that can express some endothelial markers but are not “true endothelial progenitor cells” (EPCs). MSCs, which are the only cell type that shows strong proliferation during long-term adherent culture for bone marrow cells, do not differentiate toward the endothelial lineage when grown under endothelial promoting conditions.”
5 W" E! x  R9 \& f% k. uReference：
& u/ w- ]" z/ L3 e1 D( @Zhang, S. J., H. Zhang, M. Hou, Z. Zheng, J. Y. Zhou, W. J. Su, Y. J. Wei and S. S. Hu (2007). "Is it possible to obtain "True endothelial progenitor cells" by in vitro culture of bone marrow mononuclear cells?" Stem Cells and Development 16(4): 683-690

benben

我一直做骨髓内皮祖细胞，觉得还是3-4d

benben

我一直做骨髓内皮祖细胞，觉得还是3-4d去除非贴壁细胞为好，能培养出Late outgrowth cells，此种细胞具有内皮祖细胞生物学功能，这是我的实验经验，供大家借鉴，请问有培养脐带血的内皮祖的吗？我怎么一直养不活。谢谢！

zoe

回复 benben 的帖子
! ?# ?& x+ E1 X/ P3 B' h& v# g8 X7 J+ l- Q2 h) C  W
benben前辈，谢谢您分享经验。请问您用的是什么培养基？您的EPCs纯度如何？传代后形态还能保持得很好吗？