神经干细胞移植术治疗视网膜退行性疾病 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:34 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：黄文志作者单位：（410011）中国湖南省长沙市，中南大学湘雅二医院眼科

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      【摘要】  各种退行性视网膜病变缺乏常规的治疗方法,通过干细胞移植,使其整合入视网膜各层并且分化为目标细胞,以重建视网膜功能,给不可逆性盲眼患者带来了曙光。近年来视网膜干细胞移植的试验性研究取得了重大的进展。现就视网膜神经干细胞移植的供体材料来源、诱导分化及影响因素和试验研究的最新进展作一综述。 ; e3 }. u, o; \5 B" x( [% r
      【关键词】视网膜细胞移植神经干细胞基因治疗生物可降解多聚体8 Z4 R" J. ]5 i! {$ [4 J7 `
   　0引言
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　　视网膜变性性疾病是一组由于视网膜感光细胞变性凋亡所导致的严重的致盲性眼病，在哺乳动物视觉系统的变性性疾病中，视网膜内特殊细胞群的死亡往往导致视力损害，甚至失明。比如:年龄相关性黄斑变性(agerelated macular degeneration，AMD)、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)［1］。因为这些致盲性的视网膜变性性疾病都存在进行性的视网膜细胞丢失，常规的药物治疗缺乏疗效，所以理想的治疗方法是替代这些丢失的细胞。通过视网膜的细胞移植来代替丢失的细胞或者起到支持细胞的作用，以阻止更进一步的细胞丢失，这一可行的防盲治盲方法越来越多地被视光学工作者考虑到并且运用到临床。眼睛的解剖结构明确、具有透明的屈光介质、便于操作定位及观察，这些特点使得视网膜疾病与其他神经系统疾病相比，在细胞移植方面发展得更为迅速。20世纪八十年代后期，试验性的视网膜组织移植研究开展了很多。其机制在于通过在视网膜下腔移植健康的视网膜组织，使其融合到宿主的视网膜组织中，以形成有功能的单位，来达到重建变性视网膜的目的。近年来已经进行了一些临床上的尝试，但是对视觉功能的恢复有限［25］。因此人们开始转向寻找合适的细胞源作为移植物,Ourednik等［6］认为神经干细胞是最适合于中枢神经系统细胞替代治疗。

　　1神经干细胞的特点
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　　神经干细胞作为一种具有多分化潜能的原始细胞，具有以下特性［79］：(1)具有自我更新能力并且能在培养基中增殖；(2)具有多向分化潜能，可生成神经组织等；(3)来源广：其广泛存在于成体组织中。哺乳动物的神经干细胞分布于大脑皮质、脑室周围、纹状体、海马、嗅脑、间脑、中脑、小脑、脊髓、视网膜等处，在较长的时间内都能保持自我复制、更新、增殖的能力；并且在一定条件下，如创伤、缺血、退变的情况时具有反应能力，可以向神经元和神经胶质细胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)分化；(4)移植到神经组织中后具有远距离迁移的能力，并且能特异性地表达神经巢蛋白(nestin)等细胞标记物；(5)可被基因修饰，移植到体内易于表达外源基因。7 z% ]# l) {7 a
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　　2神经干细胞的来源: a, ]' ~  D0 n7 V: F$ s- G
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　　2.1胚胎干细胞胚胎干细胞作为哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞，具有很强的自我更新能力和多向分化潜能和低抗原性，这使其非常适合移植研究和治疗。以往视网膜细胞移植受到合适的细胞群，如神经干/祖细胞的供体来源的限制；但是，通过诱导分化胚胎干细胞为特定的细胞类型，可以获得大量的移植细胞，这就使得细胞替代治疗更加可行。目前已经明确人类胚胎干细胞在体外实验中能定向分化为造血干细胞［10］、心肌和骨骼肌细胞［11］、上皮细胞［12］和神经细胞［13,14］；另外，有研究表明将胚胎干细胞通过维甲酸诱导分化后得到的神经干细胞移植到视网膜下腔后，神经干细胞进一步分化为神经元网络结构和神经胶质细胞［15］。但是有用的人胚胎组织，无论是来源于选择性流产(自发性流产胚胎组织多具有遗传缺陷而不适用于移植)，还是体细胞克隆，都受到伦理和道德的限制。对于同种异体胚胎干细胞移植而言，虽然视网膜下腔被认为是免疫赦免区，但并不是绝对的，目前研究表明排斥反应主要是细胞介导的宿主迟发型超敏反应。不容忽视的另外一个重要问题是：由于胚胎干细胞的无限自我更新能力和多分化能力使得其具有潜在的致瘤性。Arnhold等［15］对视网膜下腔胚胎干细胞移植后的长期疗效观察表明，50%的试验鼠视网膜下腔胚胎干细胞移植物发生肿瘤(以畸胎瘤为主)。* L' e$ F% M& {: J

　　2.2成体组织来源的神经干细胞哺乳动物的神经干细胞除了广泛分布于大脑皮质、脑室周围、纹状体、海马、嗅脑、间脑、中脑、小脑外，视网膜来源的神经干细胞也得到了证实。早在上世纪五十年代，人们就发现鱼和两栖类动物的视网膜能够终身生长。随后的研究证实了新生的视网膜神经元均源于视网膜的周边区域睫状边缘带(ciliary marginal zone，CMZ) ［1618］。此后的研究发现鸟类CMZ也存在视网膜神经干细胞（Retinal Neural Stem/Progenitor Cell），而哺乳类动物的视网膜内也存在可以分化为视杆细胞、双极细胞和Müller胶质细胞的视网膜神经干细胞。而在最近的研究中［19］，研究人员通过免疫组织化学的方法进一步发现，在人类胚胎和成人的视网膜及睫状体的某些部位均表达神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白（Nestin），同时这些部位的细胞在体外培养中显示出自我更新、增殖和多向分化的潜能，从而推断人类视网膜神经干细胞同样存在。较其他用于视网膜移植的干/祖细胞而言，来源于视网膜的神经干/祖细胞一直处于视网膜的生长、发育环境中，具有更大的向视网膜细胞分化的潜能。皮肤组织来源的神经干细胞也得到了证实：Shih等［20］通过分离和培养人类头皮组织中的间充质样干细胞，得到了神经干细胞，为自体神经干细胞移植提供了新的可选择的细胞来源。
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　　3神经干细胞的移植方式
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　　由于从机体组织中获得的神经干细胞数目有限,而神经干细胞又具有很强的自我更新能力并且能够保持自身的稳定性，因此通过体外传代培养后可以获得充足的细胞源。干细胞移植视网膜主要通过两条途径实现：一是玻璃体腔移植，一般将带有玻璃微型针头的微量注射器在角膜巩膜缘扁平部插入玻璃体腔，抽出1.5μL左右的玻璃体，再注入等体积的干细胞悬液［21,22］。另一种方法是视网膜下腔移植,通常是在光学显微镜下,使用微型刀片在视网膜赤道部做一小切口,然后用带30号针头的微量注射器穿巩膜、脉络膜进入视网膜下腔,注入3～4μL细胞悬液［23］。由于移植的干细胞具有迁移整合能力,通过上述两种方法,细胞均可整合入视网膜,但Pressmar等［21］认为视网膜下腔注射损伤较大,且容易造成视网膜脱离。

　　4神经干细胞在体内的分化及其决定因素
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　　神经干细胞移植到视网膜下腔或者玻璃体后,能够整合到宿主的视网膜中,并且能够穿过变性的视网膜,进一步分化为感光细胞、神经胶质细胞,并且研究观察到其突触能够长入丛状层、神经纤维层和视神经［24］。Henry等［25］的最新研究证实了,从视网膜中分离的一种神经干细胞在移植到视网膜萎缩的鼠眼后,发育为感光细胞。更为奇特的是,移植后的神经干细胞表达了恢复蛋白(recoverin )和视紫质(rhodopsin)以及锥体蛋白(cone opsin)；他们还进一步指出,神经干细胞的迁徙特征和整合性主要取决于其本身的发育不成熟性；因为Zhang等［26］的前期研究表明通过睫状神经营养因子预先处理的视网膜来源的神经干细胞移植后上述现象不能出现。该观点得到了Qiu等［27］的试验证实，他们通过将胚胎来源的视网膜干细胞分别在体外环境下用全反式维甲酸诱导和移植到视网膜下腔诱导分化，在两组都观察到了显著的视网膜特性的细胞分化,因此认为视网膜干细胞自身的信号在细胞的分化方向有明显的作用。除了神经干细胞本身的因素外,Sakaguchi等［28］通过将神经干细胞移植到年龄为从出生后5d到成年的巴西负鼠(Brazilian opossum) 玻璃体内,观察、比较移植细胞的存活、分化和形态学融合,认为另外一个影响移植细胞分化和与宿主细胞整合的重要因素是宿主的发育状态、年龄。更为令人鼓舞的是, Henry等［25］观察到了视网膜变性鼠在移植视网膜干细胞后与对照组比较视觉功能得到了一定程度的恢复。虽然目前不能具体解释,但很可能基于以下两点:(1)神经干细胞迁移和整合后形成新的神经连接通路;(2)视杆细胞和视锥细胞功能得到保护和上调。Seiler等［29］采用了一种新方法验证了视网膜移植细胞与宿主视网膜建立的广泛的细胞连接，他们通过在宿主脑组织内注入伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV),然后通过电子显微镜在移植物细胞内观察到了PRV病毒。目前，视网膜神经干细胞移植仍然面临以下问题：如何才能获得稳定的植入干细胞与宿主视网膜的功能性整合，包括干细胞发育为成熟的功能性神经元，特别是感光细胞，以及研究宿主残留的视网膜网络结构与植入细胞形成的新网络结构的相互作用；如何才能保证植入干细胞的长期存活、整合、分化以及发挥功能。随着基因工程和生物材料工程学的发展以及与干细胞工程的结合，研究人员开始对视网膜神经干细胞移植术进行改进。
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　　5神经干细胞移植的发展趋势; s$ O9 L$ l4 S4 m" ~: @3 q
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　　5.1神经干细胞移植与基因治疗相结合年龄相关性白内障、色素性视网膜变性、青光眼等疾病的眼底病变都与细胞凋亡有关［30］；而随着视网膜变性性疾病发病机制的分子水平的了解,发现其中一部分疾病与基因突变有关:如Leber先天性黑朦(leber congenital amaurosis，LCA)与RPE65基因突变有关［31］。那么,能不能通过移植经过基因修饰的神经干细胞来达到一方面提供多种细胞因子来延缓视网膜细胞凋亡,另一方面又能通过移植入正常基因型的干细胞来替代一部分有变异的视网膜细胞呢?目前研究证实,多种生长因子具有延缓视网膜细胞凋亡的能力,包括碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状营养因子(CNTF)、神经生长因子等［3234］。经过基因修饰的神经干细胞移植入视网膜后,在视网膜增殖分化,可以替代损伤调亡的视网膜细胞;不仅如此,还可以充当生物反应器,不需要多次注射而能够不断分泌神经营养因子,使其在视网膜持续高效的表达,并且携带外源基因的靶细胞在体内合成的内源性蛋白,还可以经过适当的翻译后修饰过程,可以识别更多的配体,与细胞表面受体结合更有效,因此表达的神经营养因子活性更高。不仅可以增强宿主视网膜的抗打击能力,而且更有利于自身在宿主体内的存活、迁移、整合、分化。

　　5.2神经干细胞移植与生物可降解复合物共同移植虽然许多研究表明了神经干细胞移植到宿主视网膜下腔或者玻璃体内后能够在宿主视网膜内迁徙并且可与宿主视网膜整合,分化为多种视网膜细胞并且建立结构性和功能性的细胞连接。但是由于区室(Compartment)的存在对植入细胞的影响［35］,细胞在宿主体内的存活和转运仍然受到限制,这就制约了其临床运用。而纳米生物材料学技术的发展带来了新的曙光。目前应用的纳米材料以可生物降解性的聚合物体系和天然大分子体系为主,前者如丙烯酸烷基酯、聚丙烯酰胺、乳酸乙醇酸共聚物等;后者如蛋白质、明胶、多糖等。实验证明其在眼表和眼内具有良好的生物相容性［3638］。Minoru等［35］的最新研究比较了传统的视网膜下腔视网膜干细胞移植和用PLLA/PLGA聚合物包裹的视网膜干细胞视网膜下腔移植,结果发现植入后4wk后者的干细胞存活是前者的10倍,迁移细胞数是后者的16倍;而且植入的干细胞与宿主的视网膜融合、分化并且表达了多种感光细胞和神经胶质细胞特异标记物，提示了神经干细胞与生物可降解复合物共同移植能够提高移植细胞的存活以及总产率。
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　　总之,视网膜的神经干细胞移植技术对于多种目前缺乏有效药物治疗的视网膜疾病而言,是一种极有潜力的治疗手段。神经干细胞的自我更新、多分化潜能,使得其非常适合与细胞移植;而机体内广泛存在的神经干细胞加上体外培养扩增技术为我们提供了充足的细胞源。大量的动物试验证实了神经干细胞移植到视网膜下腔或者玻璃体内后能够在宿主视网膜内迁移和分化为多种神经元和神经胶质细胞,并且能够发出突触,建立广泛的细胞连接,形成有功能的网络结构。而基因治疗技术和纳米生物学材料的发展为解决视网膜神经干细胞移植所存在的问题提供了新的思路，更进一步的推动了神经干细胞移植技术的发展。然而，目前所进行的试验主要集中在啮齿动物模型，在运用到临床前，为了能够更好地证明其有效性，需要在更大的动物模型上进行，如猪、狗、猴。因为这些动物模型与人类有着更近的生物同源相似性，能更好地模拟人体的情况。此外，如何对神经干细胞分化为成熟神经元并且与宿主视网膜建立功能性网络结构进行诱导，并且在防止可能出现的肿瘤性分化等方面仍然需要更进一步的研究。相信在不久的将来，这项技术能成为解决多种难治性视网膜疾病的有利武器。( g$ R" S3 V. a
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