胶原酶消化脐带

askage

目前正在做胶原酶2消化脐带过夜。1CM脐带加入1ml 2mg/ml的胶原酶以及1ml 培养基。绝大部分组织都消化干净。得到的消化物太粘，加2倍体积的PBS稀释，离心（1500RPM 5MIN）还是分离不开。请教诸位有做过的，该怎么处理？消化体系有无问题，消化物该用多大倍数缓冲液稀释，才能将细胞离心沉淀下来？

呼吸

没做过，我们都是直接提取华通氏胶，剪碎 培养，效果不错。

xiaodiao123

有人是这样做的：主要有组织块贴壁法、双酶消化法，两种方法中我建议要是不急的话选用前一种方法，因为，操作相对简单，只是时间要长点，一般要15-20天传第一代。不管用什么方法，脐带来源无菌十分重要，操作时也要注意不要污染。# k) W) s; x$ v. s% Q3 f& C. a
组织块贴壁法：PBS反复冲洗脐带，特别是在脐静脉内的血液用注射器冲洗。在培养皿内顶住脐带，先用大剪刀剪成大碎块，再用眼科剪刀细细的剪成1x1mm大小的组织块，剪碎过程中不要加入PBS，这样容易点。剪碎以后均匀铺开组织块，间隔1cm即可，倒置培养皿，放入37°培养箱，一个到一个半小时取出，见组织块已经粘附在培养皿底部，延边源缓缓加入培养基，一定不要冲起组织块，要让培养基逐渐蔓延整个培养体系，再多加点，放入培养箱内，不要动，一周后上镜看，如果有细胞沿组织块边缘出现你就赢了，可以以后间隔3天换液了，等到组织块周围细胞呈集落生长，可以传代了。9 |4 a8 ~4 s8 \1 n' t* ^9 D& n

西瓜太郎

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( B1 x! E9 \. G- Z
+ y' a+ E6 F8 U9 H7 m5 z& G大虾，能更详细点吗 ？* A# p2 p2 \: J: Z# S" u

askage

回复 呼吸 的帖子) q  P2 c) ?# t

% u9 W7 ^. h/ X# M* o3 n; @6 P# k4 T能详细说下你的操作过程吗？

呼吸

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+ M. i# m3 }# C
8 o! `# `$ S" B; m9 X5 |! G6 \大概方法是这样子的：
$ {0 B* e7 \0 D6 c- `      华通氏胶是包围脐动脉和脐静脉的那部分胶体，把脐带从中间用组织镊撕开，把脐动脉和脐静脉分离出去，剩余部分就是华通氏胶（除最外面一层皮），这是需要一定技巧的，把提出来的华通氏胶用PBS清洗2-3次，然后剪碎，大约是1x1mm大小的组织块，然后称量胶体的重量，T75的培养瓶每瓶加入0.5--0.8克左右，10ML左右的培养基，经行培养，后期就是培养传代了。' E( p( c5 g( ?5 h
       以前我们也是直接把脐带剪成组织块培养，如xiaodiao123那位朋友所说的一样，可这种培养出来的细胞很杂，不近有纤维状的细胞还有上皮样的细胞等。所以后来我们就采用了提取华通氏胶的培养方法，细胞很存，长的也很快，已经形成了很成熟的操作流程。; v; [& h7 T1 I' k" O  j; ~0 i

% v0 H" M  [- F* l( \, @仅供参考，谢谢。

amanda2010

如果不分离去掉脐血管，有没有好的办法能将混入的上皮样细胞、纤维样细胞去除啊？

sign_huhu

回复 amanda2010 的帖子0 J% d9 p" E" L& }) L2 B$ y
. H( B3 r8 y- S8 O; q6 P9 f
尝试多传几代 可能好点吧

sign_huhu

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5 I/ ~% v0 Q% \0 t你有电镜图片吗 可以发来看看嘛 谢谢

西瓜太郎

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% h  z/ p$ i% w' Q' w6 u
华通氏胶 是不是脐带内半透明的糊状物啊？是不是直接从脐带内壁刮下来再剪碎？