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李玉桃

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发表于 2010-12-4 15:05 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

神经细胞培养) J' g* M2 ~' a

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是

1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:9 m4 b; P4 K' j' D. I- f0 @0 L( {3 }8 o  l
一. 鸡胚背根神经节组织块培养, |7 t1 q7 M9 E& Z7 V( g( H7 Q6 G/ M
主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观
察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1．材料和方法  1 W4 B) M# J. i) V+ F
（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
   （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气  S" x, T5 _0 H) z
室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置
   灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧
   排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。' K$ c+ _6 `" q6 t. @5 f% e
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料: k* u8 {$ |3 }! H& P
   培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2．结果
鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。/ Q. l' @% O/ T1 c! ?
二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养
背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。8 I, z  P( S  q& Y
1．材料和方法
取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤, 然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节。鸡胚背根神经节的取材方法同前。剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105 个细胞/ml密度的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置。置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养。接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2.培养液成份: p5 N4 ]& Z+ D. A0 z* T# G
种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L);10%胎牛血清; 10%马血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脱氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3  3.7g/L,)；5 % 马血清； NGF 20ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。          0 x2 c# I  j5 R2 l; k% A
3．新生大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征
新生大鼠背根节神经元接种后4h,大部分细胞可贴壁, 呈圆形或椭圆形,直径8-14μm, 胞体周围呈现一圈光晕。神经元的细胞核位于中央或偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。接种后24h, 大部分贴壁细胞开始长出突起。其中多数为具有多个突起的多极神经元,少数为双极和假单极神经元, 突起细长,并可观察到突起末端的生长锥。除单个散布的神经元外,还常见到几个或多个神经元聚集在一起, 它们向四周发出树枝状的神经突起。培养2-3d后神经元的突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的神经网络。随着培养时间的延长, 神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗,神经突起网络变得更加稠密, 神经元胞体逐渐增大。大鼠背根节神经元可维持培养2个月。' z# N3 p4 `" J0 n  y
4．新生小鼠背根节神经元的生长分化和形态特征
新生小鼠背根节神经元的形态结构和生长分化基本上与新生大鼠相似,但小鼠背根节神经元的胞体较大鼠稍小。神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。小鼠背根节神经元亦可维持培养2个月。( g* m: d7 z3 U# g. |
5．鸡胚背根节神经元的生长分化和形态特征  9 e) D5 m+ i( s6 t5 {3 k  J
鸡胚背根节神经元的生长分化基本上亦与新生大鼠和小鼠相似。但鸡胚背根节神经元以假单极为多见。与大鼠或小鼠背根节培养神经元相比,神经突起分枝较少。神经元胞体稍小,神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。鸡胚背根节神经元亦可维持培养2个月。$ [' W+ R) k* q. F) Q
三.  新生小鼠颈上交感神经元分散细胞培养) N# T  o. S- G! H
   交感神经系统在维持机体的正常功能和对环境的适应性反应中起着十分重要的作用。交感神经细胞培养特别有助于神经细胞发育和可塑性研究，利用体外培养系统可进行交感神经细胞的发生、死亡、形态和生化发育、递质表形的获得，以及靶组织与传入纤维的突触形成的研究。此外，通过体外培养系统可获得关于神经营养因子、激素，细胞因子等调节交感神经元发育的信息，了解传入纤维的输入以及与靶组织的联系的机制。
1．材料和方法 & a- @$ T5 t( j. l) O3 H0 I+ o
实验用出生当天的昆明种小鼠，在无菌条件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖镊在解剖显微镜下找到气管两侧的颈总动脉,并以此为标志,在颈总动脉分为颈内外动脉交叉处找到上颈交感节,  取出上颈交感节, 置于含 1 % 胶元酶(Collagenase)和1 % 消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37℃， 1 h)分散后，用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的的细胞悬液；接种于涂有小牛皮胶或以小鼠脑皮层胶质细胞为背景的35mm塑料培养皿中，每皿2ml细胞悬液置。置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液,改用饲养(Feeding)培养液培养。接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液,以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
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2．培养液成份- Q" V( {/ G2 N% ^6 e+ v7 l
种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L)；10%胎牛血清；10%马血清；NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脱氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。5 a- X  P2 B9 Y4 u" T
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5%马血清； NGF
            20 ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。; Z: u) L9 f( u8 g0 Z0 _' |
3．新生小鼠交感节神经元的生长分化和形态特征& G9 l. \! j3 v  y. p
新生小鼠交感节神经元在含 NGF 的培养液中种植后4h, 细胞即开始贴附在胶元薄膜或在皮层胶质细胞层上生长, 交感神经元的胞体一般为圆形, 有时亦可见椭圆或梭形,体积较大, 直径约8-14μm左右,胞体周围呈现一圈光晕,神经元的细胞核大多偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。接种后24h, 大部分贴壁神经元开始长出突起。培养2-3天后,神经元突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的网络。随着培养时间的延长, 神经突起网络变得更加稠密。神经细胞的主干和分枝明显延长并增粗, 神经元的胞体逐渐增大。小鼠交感神经元可维持培养1-2个月。( o! u) r$ ^, l3 Z1 _
四.  胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元培养，# Q, N0 x3 {& C7 ]
中枢神经系统包括脑和脊髓，脊髓是中枢的初级部分，其功能有二，一是传导感觉和运动冲动，二是完成躯体运动的基本反射。脊髓突然被横断并与高级中级失去联系后产生脊休克。因此，利用体外培养的脊髓腹角运动神经元进行脊髓损伤和修复的研究日益受到重视。
1．材料和方法' k1 q, l7 e/ Q( h4 M& o* t% J& W( C
用12-14d 胚龄的小鼠、12-14d 胚龄的大鼠、孵化10 d 的鸡胚，在无菌条件下取出胎鼠或鸡胚脊髓，剥除脊膜后,将整个脊髓腹侧面朝上置于平皿中，用微解剖镊和双面刀片沿脊髓中央管纵切两半，再将脊髓两侧的腹侧部分切下，将组织块切碎，用0.125% 胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成5×105个细胞/ml密度的细胞悬液,接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置36℃、10%CO2的培养箱中培养,24h后倾去培养皿内种植培养液, 改用饲养培养液(同第二节)进行培养。以后每周换液两次,每次更换50%的新鲜饲养培养液。/ M" t& x7 t7 y% z7 v) e0 ^( O: r0 O' T
2．胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元的生长分化和形态特征
胚鼠和鸡胚脊髓腹侧神经元培养12h后,大部分神经元可贴壁,贴壁神经元呈圆形,直径5-8μm,其中少数神经元开始伸出1-2个突起。培养24h后, 神经元突起逐渐增多并延长,形成稀疏的网络,培养的脊髓神经元以双极和多极为多见, 神经元呈圆形或椭圆形及多边形不等,胞核清楚,多数具1-2个核仁。随着培养时间延长, 神经元突起进一步增多、增粗并延长,形成稀疏的神经网络, 神经元胞体逐渐增大。多极胞体大的神经元逐渐增多,经胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组织化学染色和乙酰胆碱酯酶(AChE)组化染色呈阳性反应。此后，只要定期换液并适当抑制非神经细胞的过度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和鸡胚脊髓腹侧运动神经元在体外可维持培养2个月。
五. 新生大鼠海马神经元分散培养  * O5 n7 s0 g7 S7 ?
海马属大脑边缘系统，与情绪、学习及记忆有关，它具有明显的长突触传递的长时间程长时程增强（LTP）和长时程抑制（LDT）的能力。LTP和LDP具有协动性、特异性、长时性的特点，目前已被认为是学习和记忆的基础。而且海马组织常常是引起癫痫发作的病变部位，并且海马细胞对缺血、缺氧特别敏感。这些特征反映了海马神经元的内在性。例如，对缺氧的可塑性和易感性均与NMDA（N-methyi-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸）受体的独特性质相关。海马具有中枢神经系统的典型特性，有相对同源性的神经元群体，据估计，海马主要的细胞类型---锥体神经元占海马全部神经元的85%-90%。海马CA1和CA2区含有的锥体细胞在电生理特性及其相互连接的形式上各不相同，并能分别进行培养。海马锥体细胞具有特征性的形态，它们有单根轴突和数根树突组成，所有的树突都高度分化并密布树突嵴。此外，海马锥体神经元相互之间与中间神经元群体之间均有直接联系，在体外培养系统缺乏外源性传入纤维的情况下，海马神经元相互间仍然能产生广泛的突触联系。! a9 ^% p& K+ ?" \4 W0 e
1．材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧海马，用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成5×105个细胞/ml密度的细胞液, 接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置标本于36℃,含10%CO2的培养箱内培养。24 h后顷去培养皿内种植培养液,改用饲养培养液(同第二节)培养。接种第5 d,在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5'-氟- 2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷 3μg/ml以抑制非神经细胞的过度增殖, 作用48h 后更换新鲜培养液,以后每周换液2次,每次更换50%新鲜培养液。
2．新生大鼠海马神经元的生长分化和形态特征% M* K/ Z0 X( ^4 C
新生大鼠海马神经元种植后12h,大部分细胞可贴壁,呈圆形, 其中少数神经细胞开始伸出1-2个突起。培养24h后,伸出突起的神经细胞逐渐增多, 突起一般为20-40μm,长者可达60μm。培养3d后, 神经元突起进一步增多并延长,形成稀疏的网络。培养的海马细胞以锥体细胞为多见,胞体较大,直径6-12μm。随着培养时间的延长,神经元胞体逐渐增大,胞突主干和分技明显延长并增粗,形成更加稠密的网络。海马神经元在体外可维持培养2个月。
六．新生大鼠隔神经元分散培养
隔亦属大脑边缘系统，主要与一系例内脏活动、躯体活动，情绪活动有密切关系。
1．材料和方法% w8 w3 Q) K5 J0 J) P6 d
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧隔区，培养方法同海马神经元培养。$ T4 |* s- ^3 r+ ^
2．新生大鼠隔神经元的生长分化和形态特征# H2 Z9 b; v+ a: m/ f/ u/ h
新生大鼠隔区培养神经元的生长分化基本上与新生大鼠海马神经元相似。但隔神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形, 直径6-8μm。随着培养时间的延长,神经元胞体逐渐增大,神经突起逐渐增粗, 并互相联络成网。新生大鼠隔神经元亦可持续培养2个月。
七．新生大鼠下丘脑神经元分散培养+ e1 j( N/ f, T- R5 D
下丘脑，作为神经系统和内分泌系统的连接点，在神经内分泌研究中有很重要的地位。它不仅通过神经-神经，神经—体液通路与垂体发生直接的联系，以兴奋与抑制两种不同的机制维持垂体内分泌的相对恒定，而且与脑干网状结构、皮质边缘系统等共同调节机体的各种活动。下丘脑的分泌功能以及其所分泌的各种肽类激素、神经多肽是下丘脑参与调节内脏活动、生理机能以及垂体内分泌的重要物质基础。
1．材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧下丘脑，培养方法同海马神经元培养。5 e. g5 U! l2 X# p% W1 C/ K
2．新生大鼠下丘脑神经元的生长分化和形态特征: z( _2 `9 d% Y& j: G
新生大鼠下丘脑神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠隔神经元相似。培养的下丘脑神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形,直径6-8μm,偶见胞体较大(直径9-12μm)的多极神经细胞。随着培养时间的延长, 下丘脑神经元胞体逐渐增大。下丘脑神经元亦可维持培养2个月。
八．新生大鼠大脑皮层神经元分散培养0 o+ c0 U) a, W# W0 f8 h
大脑皮质是大脑半球最外表的一层灰质，大脑皮质内神经元的数量极大，其类型也很多，但均属多极神经元，神经元之间具有复杂的联系，反映皮质的高度发展。有人从机能上将皮质分为：感觉皮质、联络皮质、运动皮质。' z" M  _1 {  L$ M/ x0 Q3 `/ f; _& {
1．材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧皮层，培养方法同海马神经元培养。
2．新生大鼠大脑皮层神经元的生长分化和形态特征
新生大鼠皮层元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠海马神经元相似。培养的皮层神经元中既可见到体积较大(直径8-12μm)的锥体细胞和颗粒细胞(如星状细胞、篮状细胞和梭形细胞),也可见到马提诺蒂细胞,胞体较小,呈三角形或多角形。随着培养时间的延长, 神经元胞体逐渐增大,突起增粗。新生大鼠皮层神经元亦可持续培养2个月。
九．新生大鼠纹状体神经元培养$ a- f3 \. v  A. d
位于大脑皮质下，紧靠丘脑背外侧的几块灰质，称为基底神经节，它们包括尾状核、壳核和苍白球，前两者合起来又称为纹状体。纹状体是中枢神经系统的高级部位，在这里进行着运动机能的最高级整合，它们与随意运动的稳定、肌紧张和躯体运动的整合有密切关系。中脑黑质除含有较多的多巴胺（DA）神经元外，还含有γ-氨基丁酸（GABA）神经元等，纹状体是其主要的靶组织，共同组成黑质纹状体DA系统。) _8 D3 b8 B& j% H8 w/ d
1．材料和方法/ `4 p+ ]$ O' Q% b3 i/ E
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧纹状体，培养方法同海马神经元培养。) d) X( T8 C0 B& R8 d
2．新生大鼠纹状体神经元的生长分化和形态特征# a8 m0 D: ]8 w4 r
新生大鼠纹状体神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠隔神经元相似。培养的纹状体神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形,直径6-8μm。随着培养时间的延长, 纹状体神经元胞体逐渐增大。纹状体神经元亦可维持培养2个月。2 k) Q7 e% B% C: [0 n2 W3 o' m
十．新生大鼠中脑黑质神经元培养2 b1 ~; w- s; @: T
黑质由中脑背侧的致密部和腹侧的网状部组成，中脑黑质是多巴胺神经元存在的部位，实验表明，大鼠中脑腹侧多巴胺在运动和行为中起着关键性的作用。黑质多巴胺能神经元退性病变可引起帕金森综合症。因此，多巴胺神经元的体外培养为多巴胺神经元的形态、受体分布、药物作用、电生理特性的研究以及多巴胺神经元移植研究提供了较好的实验手段。2 b# k, o( r6 a1 i0 A* n
1．材料和方法$ r2 [  D! X$ F3 ?8 a2 ]5 {4 E. s
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧黑质，培养方法同海马神经元培养。; `1 u' _& n- A) d3 v" y
2．新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征
新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠下丘脑神经元相似。培养的中脑黑质神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形,直径6-8μm，随着培养时间的延长, 中脑黑质神经元胞体逐渐增大。中脑黑质神经元亦可维持培养2个月。
十一.新生大鼠小脑神经神经元培养
小脑由外层的灰质（皮质）、内部的白质和三对深部的核团（顶核、间位核和齿状核）组成。与大脑皮质相比，小脑皮质的结构和神经元环路的组成相对简单，整个小脑皮质共有三层结构：分子层、浦肯野细胞层和颗粒层。其中含有五种神经元，即颗粒细胞，浦肯野细胞、篮状细胞、星形细胞和高尔基细胞。小脑是中枢神经系统中最大的运动机构，主要作用是维持躯体平衡，调节肌肉张力和协调随意运动。小脑的另一个与运动有关的重要功能是在技巧性运动的获得和建立过程中发挥运动学习的作用。在体外培养系统中，小脑细胞大小和形态的特征明显，容易识别。另外，小脑缺陷神经突变的小鼠种系比较多，这些条件都使小脑细胞成为发育研究的良好对象。* D$ N( q. T  h4 J
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1．材料和方法( a6 n/ r0 H3 t3 }. _' B' }
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧小脑，培养方法同海马神经元培养。
2．新生大鼠小脑神经细胞的生长分化和形态特征
新生大鼠小脑神经元的生长分化基本和新生大鼠皮层神经元相似。培养的小脑神经元以颗粒细胞为多见,体积较小,直径3-5μm,亦可见到一定数量的星状细胞,哺肯野细胞和篮状细胞(胞体直径6-8μm),它们均随着培养时间的延长,神经元胞体逐渐增大,突起逐渐增粗。新生大鼠小脑神经元亦可持续培养2个月。# N, Y  }0 _* C& X+ u% i
十二．新生大鼠脑腺垂体细胞培养* |( g( J- ^; ^  d# I6 o# D
大鼠的垂体分为前、中、后三叶，前叶亦称腺垂体，主要分泌生长激素、催乳素、各种促激素及黑素细胞刺激素。因此建立体外培养腺垂体细胞的方法，可用来探讨各种因素直接对细胞分泌功能的影响，以及开展神经内分泌分子生物学的研究。
1．材料和方法4 D; @; _/ H2 O7 w
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下分离出腺垂体，用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成2×106个细胞/ml密度的细胞液, 接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置标本于36℃,含10%CO2的培养箱内培养。24 h后顷去培养皿内种植培养液,改用饲养培养液(同第二节)培养。以后每周换液2次,每次更换50%新鲜培养液。
2．新生大鼠脑腺垂体细胞的生长形态特征% I+ A' J, _! ^3 M8 `) A
接种后24h,新生大鼠脑腺垂体分散细胞即开始贴附在胶元薄膜上生长,脑腺垂体细胞最初分散或聚集成小团,随后迅速分裂增殖。细胞境界清楚, 形状不规则,有圆形,卵圆或多角形。核位于胞体中央或偏于胞体一侧,可见1-2个核仁。随着培养时间的延长,脑腺垂体细胞胞体逐渐增大,形成单层, 铺满皿壁底层。脑腺垂体细胞可持续培养1个月。# ^( i! \6 R. D8 {# [! d
十三．神经胶质细胞培养- o. ?- a0 C- B2 `6 K1 P1 W
（一）雪旺细胞8 i# Q1 |5 J: Y
雪旺细胞（Schwann cell，SC）是外周神经系统最主要的胶质细胞，也是外周神经的成髓鞘细胞；它形成髓鞘，或包裹轴突而不形成髓鞘。雪旺细胞的功能极其活跃，一旦神经受损，它能反应性分裂增殖，分泌神经营养因子，产生细胞外基质和细胞粘附分子，对神经元及其轴突起营养和修复作用。近年来的研究表明，雪旺细胞也能促进中枢神经对脱髓鞘损伤的修复，如对脊髓的再生，对视网膜神经节以及对隔-海马通路再生等。说明雪旺细胞也能改善中枢神经再生的微环境，因而近年来对雪旺细胞的研究，尤其是体外培养研究已成热点。
1．材料和方法5 u0 Z' d0 j! e9 A- q
雪旺细胞培养取材于各类哺乳动物的外周神经和背根神经节，取孵化8-12d鸡胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流产的人胎儿，在无菌条件下用解剖镊分离出神经节，剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培养液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中, 种植密度为0.2×105 个细胞/ml，每皿2ml细胞悬液置。置36℃、10%CO2培养箱中培养。接种第3 d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml，以进一步去除成纤维细胞, 作用48小时后更换新鲜培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。# `: o1 n3 p* H8 W3 P: \$ O% U
2．雪旺细胞的生长和形态特征9 L1 z5 k( f- @! ]3 Y6 a3 [7 z% ?
培养15d后可获得较高纯度的雪旺细胞，雪旺细胞呈双极梭状，核卵居中，相互平行排列，经S-100免疫组织化学染色呈阳性反应。增殖分裂的雪旺细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。
（二）星形胶质细胞
星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大，数量最多的一种，胞体呈星形，核大，呈卵圆形，染色质稀少，星形胶质细胞分两类，一类为原浆性星形胶质细胞（protoplasmic astrocyte），其突起短粗，分枝多。另一种为纤维性星形胶质细胞（fibrous astrocyte），它的突起细长，分枝少。纤维性星形胶质细胞是与少突胶质细胞源自同一前体细胞。星形胶质细胞具有多种功能，中枢神经系统内神经元及其突起间的空隙几乎全部由星形胶质细胞充填，起结构的支持作用，星形胶质细胞的突起构成血脑屏障，星形胶质细胞能摄取和代谢某些神经递质如γ-氨基丁酸等。调节局部神经递质的浓度，使神经网络能平稳地发挥作用。还能吸收细胞间隙中过多的K+，为K+的存储库，通过调节K+的水平而影响神经元的电生理活动。星形胶质细胞能合成和分泌大量神经营养因子，有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用，亦能分泌白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等多种细胞因子，星形胶质细胞有分裂能力，在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生、肥大，填补缺损，形成胶质瘢痕。+ V- N" L. U5 L. f3 n8 w
（1）方法和结果: `+ S8 e4 L3 e) v0 v
选择出生 2 d 的SD大鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培养液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的75cm2塑料培养瓶中, 种植密度为1×105 个细胞/cm2，每瓶10ml细胞悬液置。置36℃、10%CO2培养箱中培养。每周换液2 次，培养10-14h，细胞分为两层，下一层为I型胶质细胞即原浆形胶质细胞，上一层是O-2A前体细胞，根据两类细胞贴壁能力的差异，以振荡培养技术进行分选，在37℃摇床上振荡，16 h（180r/min）O-2A前体细胞可被摇下来，摇下来的细胞种植在涂有鼠尾胶的75mcm2塑料培养瓶中，培养液使用20 % 胎牛血清促进O-2A前体细胞分化为II型胶质细胞即纤维型胶质细胞。可分裂增殖的原浆形胶质细胞和纤维型胶质细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。纯度鉴定可用胶质纤维酸性蛋白抗体（GFAP）染色确定。& ~( g- ~9 B2 o! n
（三）少突胶质细胞" \/ y. K3 D& s
  1．方法和结果
少突胶质细胞培养方法同星形胶质细胞培养。少突胶质细胞比星形胶质细胞小，光镜下少突胶质细胞胞体呈圆形或多角形，突起呈串珠状，根据其所在部位的不同可分为束间少突胶质细胞、神经元周围少突胶质细胞。在中枢神经系统内，少突胶质细胞主要形成及维持髓鞘。
讨论/ v) e2 B# l7 P3 `
在神经生理、生化和神经药理的研究中、神经细胞的体外培养日益受到重视,因为它是研究单个神经细胞功能和结构的适宜方法。在体外培养条件下背根神经节、颈上交感节、胚胎脊髓和不同脑区 (海马、隔、下丘脑、大脑皮层、小脑和垂体细胞等)培养细胞的形态特征都不尽相同，这与它们具有不同功能有关。交感和感觉神经元以及不同脑区神经元的体外培养成功, 为我们深入研究它们的结构和功能提供了合适的体外实验模型。在背根节神经细胞培养过程中, 我们观察到, 早期感觉神经元发育阶段,NGF是必不可少的营养因子,但在培养后期,神经元已发育成熟, 可能非神经细胞分泌的极少量NGF即能满足神经元生长需要,因此不另NGF也能维持长期培养。在上颈交感节细胞分散培养过程中, 我们亦观察到,若最初1-2d在培养液中缺乏 NGF,交感神经元突起不见生长,且大多死亡。培养15d或1个月时,如果培养液中未加入NGF, 本来生长良好的神经元很快便出现颗粒变性或空泡, 逐渐死亡。结果表明NGF对于促进神经突起生长和维持神经元生存有显著作用。在神经细胞培养过程中,神经细胞的生长发育受到多种因素的影响,其中细胞接种密度对细胞生长发育影响较大,一般神经细胞的接种密度以0.5-1×106 个细胞/ml密度为宜,如每毫升中超过3×106个细胞/ml密度  ,将使细胞簇过大,而且培养皿内过分拥挤, 影响存活和生长。但如果培养的细胞数目过少时,神经细胞的生长分化较差,因为神经细胞是一种细胞群体, 它们相互之间具有营养和支持作用。其次是控制非神经元细胞过多增殖。原代分散单层培养是神经细胞与非神经细胞的混合培养。其中胶质细胞等可在体外继续增殖, 神经元则不能增殖而只能生长分化。当适量胶质细胞的存在是神经细胞长期培养的必要条件,但如果神经胶质细胞过渡增殖时，神经细胞的生长分化便受到一定影响, 常使神经细胞提早开始退化。这可能是由神经胶质细胞频繁分裂过程中, 夺取了神经细胞生长中需要的某种营养成份。为保证神经元生长所需的营养, 需在非神经细胞增殖的高峰即所谓“合流”(confluence)时,将一定量的抗DNA 药物加入培养液中以抑制其过渡增殖,实验证明,在培养第5d 或第7d时使用 5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或阿糖胞苷3μg/ml,作用48h即停用可加快神经元的分化, 延长培养时间。再次是所配制的培养液必须保持一定的等渗性, 溶解于培养基的物质浓度所产生的等渗性必须与细胞外液的液体一致,培养神经细胞可将培养液的渗透压调节到320-330 mOso 较为合适。如果培养液是高渗的,细胞会失去水份并发生皱缩, 如果培养液是低渗的, 细胞会吸收水分而膨胀。两者不利于神经细胞的存活和生长。最后需注意的是须掌握换液的次数和数量。为了使神经细胞得到生长分化必须的营养,必须经常进行换液,但如果换液次数太多,并不利于神经细胞的生长分化,因为神经细胞在培养液中需要适当的环境,而且它本身也有创造良好环境的能力, 如果频繁换液就会破环这种环境。我们每周换液二次,每次只换一半, 保留一半原液。除此之外,培养液的PH、温度等均对神经元的生长发育有影响,因而在实验中必须加以注意。

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