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作者：王广雷作者单位：天津医科大学公共卫生学院，天津 300070
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【摘要】 目的 研究叶酸对胎鼠大脑神经干细胞(NSCs)增殖的影响及其作用机制。方法 采用孕14～16 d SD胎鼠，进行NSCs原代培养。将NSCs分为4组：对照组、叶酸缺乏组、叶酸低剂量组、叶酸高剂量组。收集培养6 d的细胞，采用5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入法和免疫组化双标记检测NSCs的增殖情况，采用蛋白印迹法(Western blot)检测胎鼠增殖期NSCs活化的细胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)的表达含量。结果 叶酸低剂量组、高剂量组BrdU 巢蛋白(Nestin)阳性细胞占总细胞(70.5±2.7)，(78.8±6.9)%与对照组(64.2±8.9)%比较，差异均有统计学意义，且高剂量组明显高于低剂量组(P5 j" [3 Q, h% }! } I% h
【关键词】叶酸 神经干细胞 增殖 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路
% j4 U* F# a/ n$ D& Z Effects of folate on proliferation of neural stem cells of fetal rat
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) q( E9 d$ J9 ]. z WANG Guanglei,HUANG Guowei,ZHANG Xumei,et al.$ ^) n# C! C6 |9 `6 J7 h
; p7 K+ a+ Q/ f% M( A. R School of Public Health,Tianjin Medical University(Tianjin 300070,China)2 c) ^. F7 ^9 J4 p) C
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8 k3 n4 c+ T7 g Abstract： ObjectiveTo study the effect of folate on neural stem cells(NSCs) proliferation via MARK signal pathway in fetal rats in vitro.MethodsNSCs of fetal Sprague-Dawley rat from E14d to E16d were cultured,divided into four groups which were control group,folate-deficiency group,folate-low group and folate-high group.NSCs were collected after being cultrured 6 d.The proliferation of NSCs was detected by BrdU in corporating method and immunohistochemistry method.The level of pERK1/2 expression were detected by western blot method.ResultsThe percentage of Nestin and BrdU positive cells in total cells(±s) in folate-low group(70.5±2.7) and folate-high group (78.8±6.9) was significantly higher than that in control group 〔(64.2±8.9)，P
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Key words： folate;neural stem cell;proliferation;MARK signal pathway/ G( s% z- `3 v) O% k
* `% X- k2 ^5 Z 叶酸是神经系统正常发育必需的，研究证实膳实缺乏叶酸的孕妇，孕前及孕后3个月补充叶酸能够有效地预防神经管畸形的发生〔1〕。Craciunescu CN等研究发现妊娠晚期膳食缺乏叶酸影响胚胎鼠端脑部分的干细胞有丝分裂和凋亡，即能延缓细胞有丝分裂周期和降低NSCs的数量〔2〕。目前研究认为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-active protein kinase，MAPK)信号通路对哺乳动物中枢神经系统发育过程和调节NSCs增殖分化起重要作用〔3〕，为此，本实验采用体外培养胎鼠NSCs，探讨叶酸通过MAPK信号通路对NSCs增殖的影响。! e; M% p K# l+ x+ @
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1材料与方法
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1.1材料(1)动物：孕14～16d SD大鼠(军事医学科学院实验动物中心)。(2)试剂：IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media)培养液(美国GibcoBRL公司)；碱性成纤维因子、表皮生长因子(加拿大Perotech公司)；兔抗大鼠多克隆抗体pERK1/2 IgG、小鼠抗大鼠单克隆抗体β-actin IgG(美国Santa Cruz公司)；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)；化学发光试剂盒(英国Amersham公司)。(3)仪器：DYY-III8A稳压稳流定时电泳仪(北京六一仪器厂)；TS-1型脱色摇床(江苏海门其林医用仪器厂)；计算机凝胶图像分析系统(美国MLTRALUMInc公司)。9 S* c1 S1 `3 J4 f+ o6 i
% o2 E# d7 X" D6 Q 1.2方法: @' r' O$ ?( d; t
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1.2.1NSCs分离培养与剂量分组孕14-16d SD大鼠，引颈处死，用75％乙醇擦拭腹部，打开腹腔，取出胚胎，剪开颅骨骨膜，取出胎鼠脑皮质，并剥除脑膜和血管，将其剪碎成0.5mm0.5mm0.5mm，加入0.25％胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，用火焰刨光的玻璃吸管吹打数次，制成单细胞悬液，再加培养液终止消化，1 000r/min，离心10min，加入NSCs培养液，过200目尼龙筛网。将细胞以1105个/ml接种于培养瓶中，每瓶约5ml。分为4组：对照组、叶酸缺乏组添加甲氨蝶呤0.41 μg/ml；叶酸低剂量组，叶酸为4 μg/ml；叶酸高剂量组，叶酸为40 μg/ml，置37℃、体积分数为5％ CO2和95％空气条件下进行培养。细胞隔天换液，并在倒置相差显微镜下观察，拍照。培养6d后，收集细胞。
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* E5 U( y G5 [ 1.2.2免疫荧光标记及染色原代培养5 d后，将终浓度为10μg/ml的5-溴脱氧尿苷(BrdU)溶于无血清培养基，过滤除菌后加入细胞中培养24 h，然后将其转移到预先铺有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁24h，用磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min，用4%多聚甲醛固定30min后，再用于巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色。对各组原代培养6d增殖的细胞进行Nestin、BrdU免疫荧光单标和Nestin BrdU免疫荧光双标染色，荧光显微镜下观察，每组随机选择10个非重叠视野计数，并计算双标记的阳性细胞占总细胞的比例，并进行统计分析。% O4 `+ D8 W, T( K7 K4 i
% A7 w5 ?. l: b& Q2 H+ _ 1.2.3免疫荧光标记及染色(rwestern Blot)收集NSCs，用预冷的磷酸盐缓冲液洗3遍，每管加入500μl全细胞裂解液［10mmol/LTris·Cl pH 7.5，1 mmol/L MgCl2，1％ TritionX-100，1% 十二烷基磺酸钠(SDS)，l mmol/L苯甲基磺酰氟］于冰上30min,4℃ 12000 r/min离心10min，收集上清，定量蛋白，分装-80℃贮存备用。SDS-硝酸银(PAGE)染色法采用5％积层胶和10％分离胶，先恒压100V，等溴汾蓝跑到层胶的分界线位置，电压换为130V，约1h。电转采用恒压80V 2h，转移后的硝酸纤维素膜用5％的脱脂奶粉封闭2h，一抗按1：500稀释，4℃过夜摇床孵育，TBST(Tris-Buffered Saline Tween-20)漂洗5min5，二抗按1：60 000稀释，室温摇床避光孵育50min，TBST漂洗5min5，化学发光，凝胶成像系统拍照。
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1.3统计分析采用SPSS 13.0统计软件处理数据，多组间比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，各组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。
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2结果0 ]7 L4 ?* V) ^8 ?( T' S# I
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2.1免疫荧光结果(图1，图2，表1)表1可见，叶酸低剂量组、高剂量组Nestin阳性细胞个数高于对照组，差异有统计学意义(P
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+ j3 f0 `7 f+ e$ Y' J ~) { 图1神经干细胞免疫荧光观察结果(Nestin染色，200)（略）4 A9 \( Z2 b% N+ C; Q/ ?
- D8 ~6 N [7 y+ i8 u8 y+ `! J1 g# q 图2神经干细胞免疫荧光观察结果(Brdu染色，200)（略）
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% K/ d* V2 G' u- | 表1免疫荧光单标染色野下细胞计数和双标染色视野下阳性细胞百分率计数（略）6 f* i3 G; n9 a) O) l* D5 g
+ L3 b6 ?( c5 P& t8 D2 Z; f# X' Q8 q7 \ 注：与对照组比较，a P8 q4 O+ u E |3 P6 k3 [
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叶酸低剂量组、高剂量组BrdU Nestin阳性细胞占总细胞百分率均高于对照组，差异有统计学意义(P
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* |/ s1 F* X% ]! X1 k 2.2叶酸对各组胎鼠NSCs pERK1/2蛋白表达的影响(表2，图3)表2可见，各组NSCs pERKl蛋白表达与对照组比较，差异均有统计学意义(P0.05)。各组NSCs pERK2蛋白的表达与对照组比较，差异均有统计学意义(P0.05)。9 q u* ^* L! H% `2 Z0 ^# q
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表2叶酸对各组胎鼠NSCs pERK1/2蛋白表达影响（略）3 W2 o7 L- ^ X: z% U
: V6 W& g2 G- y1 a. f 注：与对照组比较，a P
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注：1：对照组；2：叶酸缺乏组；3：叶酸低剂量组；4：叶酸高剂量组。1 r; E# R. y2 e7 S1 N5 b3 M
7 q, d. `3 j1 u0 H 图3叶酸对胎鼠增殖期NSCs pERK1/2表达影响（略）
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- P5 H: `; E% o 3讨论 u5 V$ L8 n/ K# E( e( B
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1 B/ [, L; _! O& l6 y 叶酸在体内的活性形式四氢叶酸(FH4)主要是作为一碳单位的传递体，参与嘌呤和嘧啶的合成及氨基酸之间的相互转化，因此，叶酸对调节神经发生、NSCs的增殖分化起到重要作用。本研究显示，叶酸处理组NSCs Netin染色阳性细胞数量及BrdU阳性细胞数量均明显增加，说明叶酸可以促进NSCs的增殖。叶酸处理组Nestin/BrdU双标阳性细胞占新增殖细胞的比例也增加，说明其细胞增殖率升高，即叶酸对NSCs具有营养和促进生长的作用。
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MAPK家族成员之一的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在中枢神经系统中高度表达。目前研究认为ERK在调节大脑神经组织的存活、增殖、分化中起重要作用〔4，5〕，ERK调节神经细胞增殖和分化过程如同激活凋亡级联反应一样〔6〕。ERK1和ERK2是神经生长因子有效反应体，如神经生长因子在细胞增殖和细胞周期过渡时，促进细胞增殖〔7〕。本研究结果显示，增殖期补充叶酸组NSCs pERK1/2蛋白的表达明显高于对照组和叶酸缺乏组(P0 o9 {( m& u9 z9 f# R, S
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发表于 2009-3-3 12:35
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