培养干细胞常用液体的配制方法

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我培养干细胞已经有四个月了，在配制常用的液体的时候，总是找别人要配方等，比较麻烦。现在我把自己总结的常用液体配方贴在这里，希望对刚开始养细胞的战友有帮助。
/ X% M& Q, u% |+ N常用的液体的配置方法：  a8 a, B! l) [: g8 |& O
①  胎牛血清：四季青胎牛血清（优级）：100ml/瓶，检查是否正常，摇匀， 56度水浴（温度计指示），30分钟，灭活。分装在大离心管中，每管33ml。-20度保存。Gibico胎牛血清，不用灭活。
% W# n, f5 K- ^! F8 s②  DMEM（低糖， Gibico）。提前一天计划好，准备DMEM ，NaHCO3 3.7g，蒸馏水，瓶子，塞子（高压），PH试纸，烧杯，量筒，磁力搅棒，滤器。星期三，刷洗量杯，烧杯，搅棒。放置搅棒在烧杯中，使用量桶取1000ml水，称取3.7g NaHco3，将DMEM放在烧杯中，倒入800ml水，冲洗DMEM 2次，搅拌均匀后，加入3.7g 碳酸氢钠。搅匀，测PH值，7.0－7.2。
! A6 j0 z2 |; M' m+ N$ z4 o③  双抗：青霉素80万U/只， 5ml水溶解，取5ml，链霉素100万U/只， 5ml水溶解，取4ml。全部溶解在32ml水中，过滤。分装1ml/管。每一管是2.5万U.－20℃冻存。 双抗标准：每1ml 100 U。所以250ml中加入2.5万U。. q4 L% u; K$ b/ i
④  培养基配制：250ml DMEM，胎牛血清33ml，（浓度11.6％）双抗2.5万（1ml，1管），提前一天解冻。配制。) u2 y0 N- T0 {  c
⑤  PBS 1000ml：
. _" S4 p: d5 }! P0 uNaCL 8g，KCL 0.2g，Na2HPO412H20 2.85g，KH2PO4 0.2g
3 u) H& f$ g0 H/ v; }PBS 500ml) u! X5 J. K' L5 q
NaCL 4g，KCL 0.1g，Na2HPO412H20 1.445g，KH2PO4 0.1g
) U& n9 Q; b5 a⑥  胰酶：0.25％胰酶＋0.02％EDTA 200ml的配制方法：
8 S- d# _( K5 `  t3 ^提前一天计划好，准备好瓶子，瓶塞，小滤器，照射，水，星期三，刷洗量杯1个，烧杯2个，搅棒，放置搅棒在烧杯中，先配制500ml PBS，放在烧杯中。称取：EDTA 0.04g， 胰酶 0.5g 。先在烧杯中加上150mlPBS，EDTA 0.04g，搅拌，加上胰酶0.5g，补PBS到200ml，调节PH 值到7.0－7.2。（使用1M碳酸氢钠，和浓盐酸，注意防护）过滤，分装。冻存。
$ |9 p- e# X$ b/ {$ m⑦  DAPI配制方法：使用三蒸水 10ml，DAPI 10mg，溶解，1mg/ml。分装在冻存管中，－20度保存，闭光。
# s' p- v9 Y3 {) w3 W⑧DAPI 标记的方法：9 v1 S- v) ]0 e: _- B
在移植前一天标记。向待移植的细胞培养皿中加入DAPI。浓度 50ug/ml,也就是4ml培养基对0.2ml DAPI工作液，注意避光，无菌操作。移植前使用PBS洗6遍，使用DMEM混悬，每一皿细胞混悬在0.5mlDMEM中，放在1ml apendop管中，备用。DAPI标记率的检测：' g8 h) g4 s+ |2 z6 R. }
选取标记后的细胞计数，计算标记细胞占总细胞数的百分比。
/ P- j1 j  I" f⑨ brdu溶解和标记方法：, c2 m8 T; L! O5 D7 j
100BRDU用100双蒸水溶解,过滤,浓度 1mg/1ml。分装1.8ml的冻存管中。部分使用50ml一个，15ml三个，其它的使用冻存管。－20度保存，避光。(Solubility and Solution Stabilityt is soluble at 10mg/ml in water. It is also soluble in DMF, DMSO and water(with heat) at 50-100mg/ml.Solution at neutral pH should be stable for at least 6 months when stored frozen at –20℃)。使用方法：在细胞传代后第2天，在 100ml培养基中加入BRDU 0.3ml（1mg/ml）,即3ug/ml，10umol/ml，继续培养，直到传代后第6天，细胞大约60－80％时候，PBS洗涤，备用。标记率大约在60％。(但是有人说使用标记的浓度是10ug/ml, 说明书上说标记的时间过长，对细胞有损伤，标记时间48小时。)使用brdu一抗（鼠抗brdu），TRITC免疫荧光技术标记，并且计数细胞个数百分比。 . F4 S) F/ O( X9 E) y3 d: p+ N

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