骨髓基质干细胞移植治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:36 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：刘长安，王江泳，张卫平，步建立作者单位：（解放军白求恩国际和平医院骨科，石家庄  050082） ' W+ n& r7 t) g1 ]


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      【摘要】  ［目的］探讨骨髓基质干细胞移植对股骨头缺血性坏死的治疗作用和修复机理，为临床应用提供依据。［方法］24只新西兰大白兔随机分为两组，A组为髓芯减压组，B组为干细胞移植组。采用液氮冷冻法造模。A组钻孔后植入空白明胶海绵，B组钻孔后植入复合有骨髓基质干细胞的明胶海绵。术后每组分别于2、4、6、8周各处死3只动物，做X线及组织学检查。［结果］（1）X线结果：2周时A、B组钻孔区均呈低密度，4周时A组钻孔边缘密度增加，B组整个钻孔区密度增加，8周时A组钻孔区均呈低密度，边缘形成硬化线，B组钻孔区形成骨小梁结构。（2）组织学结果：2周时A组钻孔区出现少许炎症细胞，边缘出现较多成骨细胞并有骨组织形成，至8周时，钻孔区内形成骨髓组织，只在边缘形成骨小梁结构。2周时B组钻孔区有大量的成骨细胞，边缘有较多骨组织形成，4周时钻孔区内充满新生骨小梁结构，8周时钻孔区内骨小梁成熟，小梁有骨髓组织填充。［结论］骨髓基质干细胞对兔股骨头缺血性坏死有良好的修复作用。 # z' A  S- h" S# _, l4 v, e
      【关键词】股骨头缺血性坏死；  动物模型；  骨髓基质干细胞；  细胞培养；  移植
   　　Experimental study on treatment of femoral head necrosis in rabbit with transplantation of bone marrow stromal cells∥8 w  W6 u, O4 O, v

　　LIU Changan,WANG Jiangyong,ZHANG Weiping,et al.
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　　Department of Orthopedics,Bethune International Peace Hospital of PLA,Shijiazhuang 050082,China

　　Abstract：［Objective］To investigate the repairing effect and mechanism for treatment of femoral head necrosis on transplantation of bone marrow stromal cells.［Method］Twenty-four Newzland rabbits were divided into two groups randomly,Group A as core decompression group and Group B as Bone marrow stromal cells autograft group.Animal femoral head neorosis model was made by freezing method with liquid nitrogen.After freezing and drilling,The drilled necrotic cavities of Group A was implanted with gelatin sponge,while of Group B was with gelatin sponge combined by bone marrow stromal cells.Three animals in every group were sacrificed respectively at 2,4,6,8 weeks and subjected to radiograph and microscope examination.［Result］（1）Radiograph examination:At 2 weeks,the drilled holes in Group A and B all presented low density images.At 4 weeks,the density in the drilled holes increased in group B and the density around the drilled holes increased in group A.At 8 weeks,sclerotic line formed around the drilled holes in Group A and trabeculae appeared in the drilled holes in group B.（2）Microscope examination:in group A,at 2 weeks,a few inflamatory cells appeared in the holes with many osteoblasts and ostoid appeared around the drilled holes.At 8 weeks,marrow formed in the drilled holes in group B,at 2 weeks,there were a large amount of osteoblasts in the drilled holes and some ostoid formed around thc drilled holes.At 4 weeks,the drilled holes were full of trabeculae.At 8 weeks,the trabeculae matured with the marrow appeared in the intertrabecular space.［Conclusion］Bone marrow stromal cells autografting may be an effective way to treat rabbit femoral head necrosis.

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　　Key words：femoral head necrosis；animal model;bone marrow stromal cell；cell culture;transplantation3 q5 P2 ~- F1 t

　　近年来一些研究发现骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cell，BMSC）减少与股骨头缺血性坏死有密切关系。有报道用自体红骨髓移植治疗股骨头缺血性坏死取得了较好的疗效。认为移植于股骨头内BMSC的数目决定着治疗的成败。本实验用移植体外增殖的BMSC治疗兔股骨头缺血性坏死，探讨BMSC在早期股骨头缺血性坏死治疗中的作用及修复机理，为临床提供理论依据和合理的治疗方法。; F4 p5 p" L/ b0 [6 f) R

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　　1材料与方法% l6 q: g# R  `# v3 y3 z; d8 i
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　　1.1动物分组

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　　成年新西兰大白兔24只，雌雄不限，年龄4～5个月，体重2.5～3.5 kg。由白求恩国际和平医院动物实验室提供。随机分为A、B 2组，每组12只。A组为髓芯减压组，B组为细胞移植组。% }* V1 k& U/ R* t$ @

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　　1.2主要试剂5 v0 B' e" p' v( W
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　　地塞米松磷酸钠注射液，浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字：H330220827，批号：041105。DMEM细胞培养液，GIBCO公司。胎牛血清，杭州四季青公司。# u, L4 F6 b2 S/ _7 Y$ Q

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　　1.3BMSC的获取和培养5 Q  U( ^9 @! L
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　　从实验动物髂后上嵴处抽取骨髓。全骨髓培养。用硬膜外穿刺针刺入髂骨1～1.5 mm，以含有100 μ／ml肝素0.2 ml的5 ml注射器，迅速抽取骨髓2 ml，所获骨髓种植于6孔细胞培养板内，每孔种植1 ml，每只实验动物种植2个孔。加入含20%胎牛血清DMEM液5 ml，反复吹打，再加入地塞米松10-8 mmol／L，微型震荡器上震荡2 min，然后放入细胞培养箱内培养。培养箱温度37 ℃，含5%CO2，100%饱和湿度。5 d后换液，冲去红细胞，可见多个成纤维细胞克隆贴壁生长。待细胞长满培养孔面积一半时，用0.25%胰蛋白酶消化，原孔传代，2～3 d可见细胞长满培养孔，将其按1106／cm2密度传入细胞培养瓶内。待第3代细胞长满后，消化细胞并将细胞配成2106／ml细胞悬液，复合于3 cm4 cm的明胶海绵上。每块明胶海绵含细胞悬液50 μl，共10万个细胞，在细胞培养箱中孵育4 h备用。

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　　1.4动物造模及细胞移植5 i$ r! M) @7 F, T, n. D+ ?

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　　所有动物双侧股骨头均参加实验。取俯卧位。硫贲妥钠40 mg/kg腹腔麻醉。后侧入路，暴露股骨头后不脱位。用液氮棉球连续冷冻3 min。自然复温后，用直径为3.5 mm钻头从股骨颈内后侧向股骨头内钻入4 mm，到达关节软骨下。A组钻孔后，植入明胶海绵。B组钻孔后，植入复合有自体BMSC的明胶海绵，关闭伤口。术后连续3 d臀大肌注入硫酸庆大霉素注射液，2 ml／只，每日1次。两组各于术后2、4、6、8周各处死3只动物，作大体观察、X线检查和组织学观察。+ B0 X: R8 x- D* \- v9 w

　　2结果

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　　2.1BMSC的生长观察及鉴定7 J4 A7 ^6 H" v. P

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　　骨髓培养到第5 d，冲去表面红细胞，可见每个孔内有3～7个成纤维细胞样克隆集落贴壁生长，呈放射状，直径大小不等。单个细胞呈长梭形，胞浆丰富，细胞核居中，换液2～3 d后细胞克隆增大，待细胞生长占满培养孔一半时，消化传代。消化传代后细胞首先呈圆形透亮，2～4 h后贴壁生长变成短梭形，2～3 d后细胞长满培养瓶底，呈长梭形紧密排列。3代细胞接种后2～7 d呈指数生长，倍增时间为48 h。8 r/ ^$ r3 l* c. x* \7 ^
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　　2.2动物的一般观察- b1 Z* @0 r3 T# u# N0 R1 r
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　　术后1周内，动物双侧后肢轻度跛行，运动减少，采食减少。而后采食增加，运动增多，步态转好。2周后恢复术前状态，伤口Ⅰ期愈合。

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　　2.3股骨头标本大体观察9 l2 P  d8 v' p9 [3 q0 D
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　　术后2周标本，A、B 2组股骨头外形均圆，关节软骨呈苍白色，A组有1个标本关节软骨面有少许剥脱。4周标本，两组股骨头外形均圆，关节软骨呈苍白色，所有关节软骨轻度剥脱。6周时，除A组有1个股骨头标本轻度塌陷外，两组其余股骨头标本外形均圆，软骨呈苍白色，关节软骨剥脱加重。8周股骨头标本，两组股骨头外形均圆，关节软骨剥脱比6周时加重，部分关节软骨下骨轻度暴露，软骨呈苍白色。7 ?: ^# [% F) H5 g4 K  R! o
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　　2.4X线观察

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　　A、B 2组标本在钻孔缺损区以外的变化大致相似，术后2周，两组股骨头密度有所增加，4周标本，除股骨头密度略比2周时增高外，其余无明显变化，6周标本，骨小梁结构出现紊乱，软骨下囊性变，8周标本，股骨头密度高，骨小梁结构紊乱加重，软骨下囊性变明显。两组标本在钻孔缺损内有着不同的变化，术后2周时，2组钻孔缺损区密度低，4周标本，A组钻孔缺损区中心密度低，边缘密度有所增高，B组整个钻孔缺损区密度增高。6周标本，A组仍呈现钻孔缺损区中心低密度，边缘高密度，B组钻孔缺损区出现骨小梁结构。8周标本，A组钻孔缺损区中心密度低，边缘密度增高，形成硬化线，B组钻孔缺损区有正常骨小梁结构。+ J  ?, |  d) P8 u' ~2 \
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　　2.5组织学观察. s* n/ n* `- E, i$ x

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　　A、B组缺损区以外的病理变化过程大致相似，都出现了坏死和修复现象，在缺损区内，两组修复现象有很大不同。A组2周标本，缺损区内有少量炎症细胞，边缘有较多成骨细胞，并且有类骨质和骨小梁产生（图1）。4周与2周比差别不大，缺损区边缘骨小梁增多。6周缺损区出现骨髓组织。8周缺损区边缘仍然在修复，缺损区出现大量骨髓组织无骨小梁组织（图2）。B组2周标本缺损区内有大量的成骨细胞（图3），缺损边缘有较多的类骨质和新生骨小梁。4周标本，缺损区内有大量骨小梁及类骨质填充。6周标本缺损区内出现比较成熟的骨小梁，骨髓组织出现。8周标本缺损区内骨小梁成熟，骨髓组织形成（图4）。

　　3讨论
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　　股骨头缺血性坏死与多种致病因素有关，除创伤性股骨头缺血坏死发病机理清楚外，非创伤性股骨头缺血性坏死发病机理并不完全明了。治疗早期股骨头缺血性坏死的目的主要是促进坏死股骨头的修复，避免出现股骨头塌陷。髓芯减压是治疗早期股骨头缺血性坏死的常用方法，其有效率在30%～90%之间〔1〕。; C% I& v/ _( `  u5 q8 _* l- ?8 A
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　　有报道〔2〕髓芯减压可以打开骨质，增加股骨头血流量，但组织学发现髓芯减压管道内，充满着幼稚的骨髓和无骨小梁结构组织，股骨头修复并不完全。这可能是由于爬行替代过程中BMSC太少所致〔3〕。Hernigou等〔4〕研究了激素和酒精股骨头缺血性坏死患者髂骨BMSC和造血干细胞数目的变化，通过对骨髓培养形成的粒细胞巨噬细胞先祖细胞（GMP）和成纤维细胞克隆形成集落单位（FCF）计数评价骨髓造血干细胞和BMSC的活性。发现股骨头缺血性坏死患者GMP和FCF计数与健康骨髓捐献志愿者相比有明显下降。表明股骨头缺血性坏死与BMSC减少密切相关。% k  s) \/ p/ W0 F" g! Z; t
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　　严军等〔5〕通过自体骨髓移植治疗兔Perthes病模型的实验研究，发现自体骨髓移植组坏死骨修复较空白对照组活跃，骺板损伤处可见少量软骨细胞，单纯钻孔组以纤维修复为主。认为由于BMSC数目较少，自体骨髓移植治疗兔Perthes病模型能力有限，体外培养增殖BMSC，增加植入细胞数目，结合适当的细胞载体，可能更有利于股骨头坏死的修复。Valerie等〔6〕运用髓芯减压加经过离心方法处理的自体红骨髓移植方法治疗13例18个处于ARCOⅠ～Ⅱ期缺血坏死的股骨头，随访24个月，骨髓移植组10个关节只有1个髋关节进入到Ⅲ期，而对照组8个关节有5个髋关节进入到Ⅲ期。
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　　骨髓移植治疗股骨头缺血性坏死可以增加股骨头内的BMSC数量，增强其修复能力。但是骨髓中含有BMSC数量有限，必然影响到骨髓移植后的修复效果。研究发现骨髓中每10万个有核细胞中才含有1个BMSC，因此增加BMSC数量仍然是这项技术的焦点。尽管人们采用各种各样的离心方法处理骨髓，以增加单位体积内有核细胞数目，但是这种方法作用毕竟有限，难以达到临床要求。因此本实验采用体外培养增殖的BMSC移植于坏死的股骨头内，以提高单位体积内移植细胞数目。4 m: |% p5 L, V7 H( d2 E
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　　本实验发现单纯行髓芯减压的股骨头，2周标本缺损处成骨细胞稀少，只在钻孔边缘形成少量的类骨质及骨小梁，随着时间的延长，钻孔区逐渐形成骨髓组织，这一点与文献报道一致。而移植骨髓基质干细胞组，2周标本缺损处有大量的成骨细胞，钻孔边缘形成较多的类骨质及骨小梁。4周时钻孔区已经被新生骨小梁填满。6周标本骨小梁相对成熟，骨髓出现。8周标本形成正常骨小梁和骨髓组织，本实验每个股骨头内移植的骨髓基质干细胞数目为10万个，这表明BMSC数目在股骨头缺血性坏死修复过程中起着重要的作用。
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　　本实验在股骨头缺血性坏死修复过程中出现了膜内化骨和软骨化骨两种形式，其规律是在坏死骨小梁周围以膜内化骨为主，在软骨面和骺板附近以软骨化骨为主。这可能与BMSC周边环境中不同的诱导因子有关。两组在钻孔缺损区以外都出现同样的坏死和修复过程，说明骨传导在修复过程中并未起明显作用。
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　　本实验采用BMSC移植治疗兔股骨头缺血性坏死取得了良好的效果，但干细胞移植的最佳密度和数量以及其与诱导因子及载体结合后对股骨头缺血性坏死修复的效果都需进一步研究。
      【参考文献】7 B3 _" z: `7 c3 {& u6 I) }
　　〔1〕  Mont MAI,Carbone JJ,Fairbank Ac.Core decompression versus nonoperative management for osteonecrosis of hip［J］.Clin Orthop，324：169178.+ ^2 m) B1 t% K$ E5 R
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　　〔2〕  卫小春.扫描电镜观察股骨头缺血坏死后的变化［J］.中华骨科杂志，1991，5：377379.
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　　〔3〕  Hernigou P，Beaujean F，Lambotte JC.Decrease of mesenchymal stem cell pool in the upper femoral extremity of patients with osteonecrosis related to corticosteroid therapy［J］.J Bone Jiont Surg,1999,81:349355.

　　〔4〕  Hernigou P,Beaujean F.Abnormalities in bone marrow of iliac crest in patients who have osteonecrosis secondary to cortieosteroid therapy or alcohol abuse［J］.J Bone Joint Surg,1997,79:10471053.. t, Z7 u  y( v  M. [; Z8 z

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　　〔5〕  严军，董天华，杨照耀，等.自体骨髓移植治疗兔Perthes病模型的实验研究［J］.中国矫形外科杂志,2002,10：790792.

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　　〔6〕  Valerie G,Jean H,Celso M,et al.Treatment of osteonecrosis of femoral head with implantation of autologous bonemarrow cells［J］.J Bone Jiont Surg,2004,86:11531160.

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