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作者：胡汉祥作者单位：辽宁医学院附属第一医院骨科，辽宁 锦州121000 6 U+ Y5 u& R) j) R) P
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【摘要】 骨组织工程是目前具有广阔研究前景的热门课题之一。种子细胞是组织工程骨构建和应用研究中的首要环节和基本要素，骨髓基质干细胞已成为骨组织工程种子细胞的重要来源。近年来对于骨髓基质干细胞分离培养、向成骨细胞诱导分化等方面都进行了深入的研究。本文在查阅大量国内外文献基础上，对骨髓基质干细胞在骨组织工程中应用的研究现状作一综述。
0 v; v( G' ], p9 z 【关键词】骨髓基质干细胞 种子细胞 组织工程 基因工程& b) r- `- z: f7 c% z! F
长期以来骨缺损的修复大多是依靠自体骨移植来完成的。近20年随着组织工程学的迅速发展，以种子细胞、支架材料和生长因子三要素构建而成的组织工程骨有望取代自体骨移植，成为实现大节段骨缺损修复最具潜能的途径之一。骨的生成是由成骨细胞向周围分泌基质和纤维，将其包埋于其中，形成类骨质，由钙盐沉积后形成骨组织而完成的，因此成骨细胞可以作为骨组织工程的种子细胞。然而成骨细胞体外扩增相对困难，异体应用存在一定免疫原性，其应用前景受到一定限制。人们在骨髓中发现除有造血干细胞外，尚有一类细胞具有祖细胞的自我增殖、定向分化特性，该类细胞称为骨髓基质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSC），它既是骨髓基质细胞的祖细胞，又可作为骨、软骨、肌肉神经等组织的祖细胞。与成骨细胞相比较，BMSC具有以下特点：1）细胞来源广泛，取材方便； 2）增殖能力强，体外易于培养和扩增；3）有多向分化潜能，在适当条件下能分化为成骨细胞执行成骨功能。基于以上原因，BMSC成为骨组织工程中最有应用前景的理想种子细胞［12］。本文就BMSC应用于骨组织工程的相关技术、问题与展望等作一综述。' h: q6 {* b! X# U1 A( Q
" z7 t9 a/ p; m* Y# S M A% O 1 取材、分离、培养. Q; z4 J8 _ h& D4 X3 U- n9 E
. }$ g( E+ N# ^& n) rBMSC的取材一般采用骨髓穿刺法，操作方便、创伤小、可反复取材而不影响细胞活力及机体功能。分离骨髓基质细胞的方法主要有三种：贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞分选术（flow cytometer, FCM）。贴壁筛选法经济方便但纯化程度有限，有待进一步改进。密度梯度离心法得到的细胞纯度可达95%［3］。流式细胞仪分选术可根据BMSC与造血细胞的表面标记的不同，用带有荧光标记的抗体从混合细胞群中获取高纯度的BMSC。BioWhittaker, Inc. 用表面分子CD105，CD166，CD29，CD44阳性和CD14，CD34，CD45阴性筛选法得到几乎完全纯化的BMSC［4］。静态单层培养法是目前较为经典的细胞培养方法。这种方法简便易操作，成本低廉，缺点是培养细胞数量受培养器皿底面积限制且不符合体内的生理环境。随着骨组织工程研究的进展，构建功能性组织工程骨已成为这一领域中的理想目标，进而对种子细胞的培养提出了更高的要求。生物反应器的使用使得BMSC的体外动态培养环境更接近于体内，从而种子细胞功能性状等各方面更加完善。有研究表明运用灌流式生物反应器不但可以进行多组织培养，而且还可以获得4.22107 ml-1的细胞密度，长时间培养仍能保持细胞的多分化特性［5］。体外构建组织工程骨需要种子细胞数量较大，使用常规的培养方法往往需要长时间培养、多次传代才能完成。微载体培养法［6］在这一方面具有显著的优点：1）兼有单层培养和悬浮培养的优点，且是均相培养；2)细胞所处的培养环境均一；3)培养条件(温度、PH值、CO2等)容易调节和监控；4)具有较高的比表面积，培养的细胞数量更多；5)培养操作可系统化、自动化，减少了发生污染的机会。真正实现骨组织工程化，种子细胞的培养应力求在体外充分模拟体内生理状态，为细胞提供最适合增殖和分化的微环境，使细胞在体外培养中保持正常的形态，具有活跃的生物学功能。如上所述，近年来种子细胞的培养方法研究已经取得了较大的进展，但要模拟真正的体内环境，尚有待更深入的研究。
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2 诱导分化
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, L' u4 w* e" ]; S微环境对细胞的分化具有决定性的作用，通过对细胞生存微环境施加一定影响，可以控制干细胞向特定的方向分化。研究表明BMSC具有多分化潜能，在适当条件下可向多个组织细胞分化［7］。如何将BMSC定向诱导为成骨或成软骨所必需的成骨细胞、成软骨细胞是骨组织工程研究的另一个重要课题。地塞米松、β甘油磷酸钠、维生素C等是目前公认的成骨联合诱导剂，诱导作用显著。崔鹏程［8］等用含地塞米松的联合诱导剂条件培养基诱导bMSC成功地向软骨分化。王骏骅等［9］用含地塞米松、维生素C、β甘油磷酸钠的条件培养基诱导鼠脂肪基质干细胞向成骨细胞方向分化。目前认为，细胞的分化和增殖是不相共存的，若想诱导细胞分化，需要抑制细胞分裂，因分裂旺盛的细胞阻碍分化［10］。地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C三种诱导物质中，β甘油磷酸钠和维生素C可促进细胞合成胶原形成钙化；而地塞米松在促进细胞的分化中起主导作用，抑制bMSC增殖，促进bMSC进入分化状态。细胞共培养诱导是借某一种成熟细胞分泌的细胞基质诱导另一种未分化细胞的方法。苗春雷［11］等在体外将猪BMSC与耳软骨细胞按不同比例接种到聚羟基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）共培养4周时检测有软骨形成。细胞生长因子通过调节细胞增殖、分化过程并改变细胞产物的合成而作用于成骨过程，在骨组织工程中有广泛的应用前景。常用的生长因子有：碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子β（TGFβ）、胰岛素样生长因子（IGF）、血小板衍化生长因子（PDGF）、骨形态发生蛋白（BMP）等。它们不仅可单独作用，相互之间也存在着密切的关系，可复合使用。TGFβ是一种广泛存在于人体组织中的生长因子，以骨和血小板中含量最高，参与人体许多组织的炎症和修复反应。TGFβ对BMSC的作用与细胞分化程度有关，早期促进增殖晚期促进分化。TGFβ对多种细胞具有促分化效应，是较强的促成骨分化的因子。有研究发现TGFβ能够抑制BMSC增殖，但能提高其ALP的表达，并能减少和延迟BMSC向脂肪细胞转化，从而提高BMSC的成骨效应。此外，TGFβ还是一种免疫调节因子，Lee［12］以腺病毒介导的TGFβ1基因转移至DC（树突状细胞），在小鼠趾蹼注射，可延长供体细胞在受体鼠体内的存活时间并提高存活数量，检测MLR（混合淋巴细胞反应）和CTL（细胞毒性T细胞）诱导，发现基因转移使免疫活化所需的共刺激信号下调。这种作用无疑可以提高移植细胞的存活率。TGFβ超家族另一重要成员就是骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）。BMP是一组具有很强骨诱导活性的生长因子，目前已知的有BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP7等十多种，其中研究最多也是成骨活性最强的是BMP2和BMP7。有学者认为，BMP首先与细胞膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶受体相结合，形成Ⅰ、Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的二聚体，然后将信息转导入细胞内，经第二信使MAD（matheragainst dpp）的磷酸化，将信息导入细胞核内，从而激活或调整DNA 的结合活性，使BMP活性相关的基因表达，产生相应的生物效应［13］。对BMP的骨诱导活性人们看法比较一致，其在体内通过募集间充质细胞，并诱导其向成骨细胞或成软骨细胞方向分化，同时协同其他调节因子共同参与诱导骨形成；在体外不仅能够调节成骨细胞的转化，对骨祖细胞以及间充质细胞均具有强烈的骨诱导活性，而且可能使诱导性骨细胞向确定性骨细胞转化。其对细胞增殖的影响目前尚有争论。Akino K 用BMP2及bFGF诱导人BMSC发现用BMP2诱导的无血清培养的BMSC在2天时细胞数目显著增多并达到平台期，且BMP2和bFGF有明显的协同作用二者合用可使平台期后延。用荧光激活分选术进一步表明BMP2使细胞周期前移G2/M期细胞比例增多［4］。Lecanda等［14］的研究证实，重组人BMP2（rhBMP2）能够提高人BMSC及肋骨来源的成骨细胞内ALP、骨钙素、Ⅰ型胶原mRNA的表达，但同时发现两种细胞的增殖受到抑制。国内学者普遍认为BMP2有促进BMSC增殖作用。毛天球等［15］观察了rhBMP2对培养骨髓细胞生物学活性的影响。结果表明，低浓度的rhBMP2（﹤0.16 mg/L）对培养骨髓细胞的碱性磷酸酶活性、蛋白质含量均有明显的促进作用，且呈剂量依赖性；高浓度的rhBMP2（﹥0.16 mg/L）对培养骨髓细胞的增殖有一定促进作用。这证实了，BMP不仅促进骨髓细胞向成骨细胞的表型转化，而且可以促进骨髓细胞的增殖。这些效应是否与剂量呈相关性有待进一步证实。最近，分离并克隆成功一种新的细胞内分子LMP1（潜在性膜蛋白1）。LMP1 表达于成骨细胞分化的前数小时，可诱导多种BMP分子及其受体和其它骨生长因子表达，Boden SD以LMP1cDNA转染骨髓细胞，在脊柱融合模型中局部植入可诱导实验组100%脊柱融合，而对照组未见成骨［16］。此外，甲状旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）对成骨的作用受到关注，它对骨转换具有双向调节作用；大剂量给药有促进骨吸收的作用；小剂量给药能促进成骨前体细胞分化为成骨细胞，发挥促进骨形成作用，国外已有临床应用的报道［17］。
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& J8 ?1 F; y* e: h1 u E 3 基因修饰% f* s6 C' i6 X t
! @. S/ Q! S/ d" z9 Z+ a# G# r用基因工程的方法将编码特定生长因子的基因导入BMSC，使目的基因在细胞内表达并合成具有骨诱导作用的生长因子，从而克服了外源性生长因子在体内半衰期短、需反复给药、大剂量给药有副作用等缺点，是骨组织工程的又一重要研究方向。许多生长因子如BMP2、BMP7、TGFβ、bFGF等不仅可通过人工基因重组产生，而且能以病毒或非病毒载体通过体外转移的方法导入BMSC内并有效表达，用来修复骨缺损取得了良好的效果。Lieberman［18］等利用腺病毒通过体外转移的方法将BMP2基因导入骨髓基质细胞，然后将该骨髓细胞与脱矿骨基质复合后修复小鼠股骨缺损，术后2个月，24处骨缺损中有22处骨性愈合。国内学者已将bFGF基因用脂质体转导入BMSC中，结果显示bFGF基因能转入成骨细胞并得到稳定表达，表达时间达4周以上。同时bFGF基因转导显著促进成骨细胞增殖和骨钙素合成［19］。在基因强化的骨组织工程研究中，对基因载体的研究日益受到研究者的重视。目前报道应用的基因载体有真核表达载体cDNA载体、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、猴空泡病毒（SV40）等。Blum［20］等比较了腺病毒、逆转录病毒、脂质体载体对转hBMP2基因小鼠MSC修复颅骨缺损的效果差异，发现腺病毒组成骨效果最显著，脂质体组最少。腺病毒载体是由人类腺病毒Type5野生型经删除E1、E3区基因改造而来的，具有宿主范围广、表达效率高、不复制等特点，同时又有8.5kb的携带容量，是近年来研究最多的基因载体。虽然动物实验证实腺病毒介导的基因转导技术安全可靠，但其对人体的安全性有待进一步证实，从而影响其实际应用。此外，为了方便的检测基因强化的种子细胞在体内的成骨活性，研究者又向种子细胞内引入报告分子基因如laz、GFP等，同时将生长因子基因和报告分子基因导入种子细胞为基因工程种子细胞在体外培养及体内成骨的检测提供了便捷的途径［21］。研究证实，随着供体年龄的增加及细胞传代次数的增加，细胞的增殖能力呈下降趋势［22］。端粒酶对于维持干细胞自我更新能力和复制潜能具有重要意义。利用端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcrip tase,TERT)基因修饰干细胞，可实现BMSC在体外长期扩增并维持某些干细胞的多向分化潜能特性，文献证实用TERT基因修饰的MSC体外连续传代培养3年后，仍保持良好的自我更新和多向分化潜能［23］。利用TERT基因修饰的MSCs建立种子细胞库有可能解决目前骨组织工程临床应用中种子细胞来源的难题，但其所致永生化细胞有否致瘤性尚需进一步研究。
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4问题与前景
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目前对骨组织工程种子细胞的选择而言以骨髓基质干细胞最为理想。但尚有一些问题有待进一步解决：1）构建组织工程骨所需种子细胞尚没有统一的细胞来源和使用操作的技术标准，建立通用的种子细胞库对骨组织工程的实际应用实属必要；2）如何克服异体细胞移植的免疫排斥问题；3）基因强化的种子细胞的基因表达调控及其在人体应用的安全性问题等。值得关注的是，国内已有学者利用基质干细胞构建组织工程骨应用于临床［24］，这可以成为骨组织工程临床应用很好的借鉴。我们有理由相信，随着研究的不断深入，新型、实用、安全的种子细胞一定会给骨组织工程的临床应用带来新的突破和创新。
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