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作者：王亚柱， 邓宇斌， 甘丹卉， 叶伟标， 叶美红， 陈永乐作者单位：（ 中山大学中山医学院病理生理学教研室，广东 广州 ５１００８０ ；中国医科大学附属第一医院血液科，辽宁 沈阳 １１０００１）
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+ d! Z1 m4 b0 M; _$ N 【摘要】 【目的】 研究体外培养骨髓来源的表达ｎｅｓｔｉｎ的成年大鼠骨髓间质干细胞（ＭＳＣ）并诱导分化神经元样细胞的潜能，为中枢神经系统疾病的细胞移植治疗提供理想的供体。【方法】 采用全骨髓法分离培养成年ＳＤ大鼠ＭＳＣ，传至第６代的ＭＳＣ接种在前一天涂有１００ μｇ／Ｌ多聚赖氨酸的塑料培养瓶或培养皿中，用含１００ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液添加１０ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ的培养液培养并以ＤＭＳＯ、ＢＨＡ与Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等诱导剂联合诱导ＭＳＣ分化为神经元。流式细胞仪鉴定诱导前ＭＳＣ的细胞表面抗原，免疫荧光检测诱导前及诱导后６ ｈ、１２ ｈ、２４ ｈ神经元特异性抗原ｎｅｓｔｉｎ、ＮＦ-２００和ＧＦＡＰ表达率。 【结果】 流式细胞仪检测传至第６代ＭＳＣ表面抗原ＣＤ２９和ＣＤ４４阳性率分为９８．８％，９６．６％， ＣＤ３４和ＣＤ４５阴性。 免疫荧光鉴定传至第６代的ＭＳＣ表达ｎｅｓｔｉｎ阳性率为５７．１％ ± ６．９％，不表达ＮＦ-２００和ＧＦＡＰ。诱导后３０ ｍｉｎ可见神经元样细胞出现，诱导后６ ｈ、１２ ｈ、２４ ｈ经ｎｅｓｔｉｎ和ＮＦ-２００免疫荧光鉴定，诱导后６ ｈ、１２ ｈ、２４ ｈ ｎｅｓｔｉｎ阳性率分别为９６．５％ ± １．９％，８８．１％ ± ５．４％，３３．５％ ± ５．４％，ＮＦ-２００阳性率分别为９０．１％ ± ２．９％，９７．５％ ± １．３％，９８．１％ ± １．６％。【结论】 骨髓来源的ｎｅｓｔｉｎ阳性的ＭＳＣ具有神经祖细胞特性并且可诱导分化为神经元样细胞，可作为种子细胞用于神经系统疾病的治疗。
$ K4 v+ v9 g: I% p1 m6 E. f 【关键词】骨髓间质干细胞；分化；神经元样细胞；神经祖细胞
9 B4 u) K6 X9 M3 C: e* r7 T Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｓｔｉｎ-ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒａｔｓｉｎｔｏ Ｎｅｕｒｏｎ-ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌｓ
5 {; T& o4 _: g( V# ^( ?" z( X0 r8 U! n" }" m7 @1 t, t! P% z
ＷＡＮＧ Ｙａ-ｚｈｕ， ＤＥＮＧ Ｙｕ-ｂｉｎ， ＧＡＮ Ｄａｎ-ｈｕｉ， ＹＥ Ｗｅｉ-ｂｉａｏ， ＹＥ Ｍｅｉ-ｈｏｎｇ， ＣＨＥＮ Ｙｏｎｇ-ｌｅ
; M7 n$ [0 e; p; @. [- [4 t4 e: S1 V4 q# ~6 q
（ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０，Ｃｈｉｎａ；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００１， Ｃｈｉｎａ ）- Y, u2 d, X$ T: S4 x
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Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ｎｅｓｔｉｎ-ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒｏｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ （ＭＳＣ） ｆｒｏｍ ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒｏｎ-ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｌａｙｓ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎ-ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｄｉｓｅａｓｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ＭＳＣ ｃａｎ ｂｅ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌｓ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｔｈｅ ＭＳＣ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ， ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐａｓｓａｇｅ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｔｈｅ ５ ｔｈ ｐａｓｓａｇｅ ｏｆ ＭＳＣ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｉｎ ａ ｐｌａｓｔｉｃ ｆｌａｓｋ ｃｏａｔｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙ-ｌｙｓｉｎｅ， ａｎｄ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １００ ｍｌ／Ｌ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ） ａｎｄ １０ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ． Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉ-ｉｎｄｕｃｔｏｒ， ＤＭＳＯ， ＢＨＡ ａｎｄ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ＭＳＣ ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ， ＭＳＣ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ； ａｎｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｓｔｉｎ， ＮＦ-２００ ａｎｄ ＧＦＡＰ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ６ ｈ， １２ ｈ ａｎｄ ６ ｈ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】ＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＭＳＣ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｏｒ ＣＤ３４ ａｎｄ ＣＤ４５， ｂｕｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ＣＤ２９ （９８．８０％） ａｎｄ ＣＤ４４（９６．６１％）． Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＭＳＣ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｏｒ ＮＦ-２００ ａｎｄ ＧＦＡＰ， ｂｕｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ｎｅｓｔｉｎ （５７．１％±６．９％）． Ａｆｔｅｒ ｈａｌｆ ａｎ ｈｏｕｒ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｓｏｍｅ ｃｅｌｌｓ ｔｕｒｎｅｄ ｎｅｕｒｏｎ-ｌｉｋｅ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｔｉｎ ａｎｄ ＮＦ-２００ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎ-ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ， ｂｕｔ ＧＦＡＰ ｄｉｄ ｎｏｔ ｅｘｐｒｅｓｓ． Ａｆｔｅｒ ６ ｈ，１２ ｈ ａｎｄ ２４ ｈ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｎｅｓｔｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐ５ ｗｅｒｅ ９６．５％ ± １．９％， ８８．１％ ± ５．４％， ａｎｄ ３３．５％ ± ５．４％ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｄｉｏｓ ｏｆ ＮＦ-２００ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ９０．１％±２．９％， ９７．５％ ± １．３％， ａｎｄ ９８．１％ ± １．６％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｔｈｅ ｎｅｓｔｉｎ-ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＭＳＣ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｐｏｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｙ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｎｅｓｔｉｎ-ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＭＳＣ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｄａｍａｇｅ．* m# Y1 x( j1 N, B0 p
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Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ； ｎｅｕｒｏｎ-ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ； ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ
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骨髓间质干细胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ， ＭＳＣ）是一类存在于骨髓中的具有自我更新、活跃增殖和多向分化潜能的干细胞，在一定条件下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞［１-４］。近年来的研究表明， ＭＳＣ可以向神经细胞分化［５-７］。国内项鹏等［８］也报道应用中药在体外定向诱导ＭＳＣ分化为神经元样细胞。 研究显示碱性成纤维细胞生长因子（ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ｂＦＧＦ）具有促进神经干细胞增殖和分化的作用［９］。本研究探讨了在涂有多聚赖氨酸的塑料培养瓶中，用添加ｂＦＧＦ的培养液培养骨髓ＭＳＣ， 培养的ＭＳＣ表达ｎｅｓｔｉｎ，具有神经祖细胞的特性，并且用ＤＭＳＯ、ＢＨＡ与Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等诱导剂联合诱导ＭＳＣ定向分化为神经细胞。从成体骨髓中获取干细胞，培养为神经祖细胞，为临床神经系统疾病的细胞移植治疗提供理想的供体。
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2 K& _7 d+ z# F １ 材料与方法& n" y, M: V) n5 ~6 w- v% C5 i
; }7 y2 s% O! I/ I9 a. A １．１材料' g1 N0 S c5 R; e+ T3 `
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１．１．１动 物ＳＤ大鼠（１．５ ～ ２月大小，购自中山大学实验动物中心） 。3 E Y6 D( w& U0 H( E# L
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１．１．２培养基及主要试剂ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）、胎牛血清（ＦＢＳ，ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ，以色列），碱性成纤维细胞生长因子（ｂｏｖｉｎｅ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ，Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ，ＵＳＡ）， 胰蛋白酶（上海生化试剂厂），ＥＤＴＡ（广州化学试剂厂），谷氨酰胺（Ｌ-ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ＧＩＢＣＯ公司），二甲基亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌ-ｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ），丁羟茴醚（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ，ＢＨＡ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ），弗司可林（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ），丙戊酸（ｖａｌｐｒｏｉｃａｃｉｄ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ），胰岛素（ｉｎｓｕｌｉｎ， Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ），ＦＩＴＣ标记兔抗大鼠ＣＤ２９抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＵＳＡ），ＦＩＴＣ标记兔抗大鼠ＣＤ４４抗体（ＳｅｒｏＴｅｃ ＵＳＡ），ＦＩＴＣ标记兔抗大鼠ＣＤ４５抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＵＳＡ），ＰＥ标记兔抗大鼠ＣＤ３４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＵＳＡ）兔抗大鼠巢蛋白（ｎｅｓｔｉｎ，博士德，中国）单克隆抗体，兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白（ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌ ａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＡＰ， ＨＥＭＩＣＯＮ，ＵＳＡ）单克隆抗体，兔抗大鼠神经丝蛋白（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ，２００ＫＤ，ＮＦ-２００，ＣＨＥＭＩＣＯＮ，ＵＳＡ）单克隆抗体，ＣＹ３标记的羊抗兔荧光二抗（ＣＨＥＭＩＣＯＮ公司，ＵＳＡ），Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）。
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8 C: |3 x/ Q n- M' r １．２方法8 H' T$ N* G/ `8 S0 n
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１．２．１ＭＳＣ的分离培养、纯化和扩增取纯种Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄性大鼠（１．５ ～ ２月龄， 中山大学实验动物中心提供），颈椎脱臼处死后，７５０ ｍＬ／Ｌ酒精浸泡５ ｍｉｎ，无菌条件下分离ＳＤ大鼠两侧股骨和胫骨，剪开股骨和胫骨两端，暴露骨髓腔，用５ ｍＬ注射器吸取含１００ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液反复冲洗骨髓腔，将骨髓细胞用含１００ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液洗一遍，再用含１００ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液重新悬浮细胞，以１１０４／ｍＬ细胞密度接种于２５ ｃｍ２的塑料培养瓶中（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ），３７ ℃，饱和湿度，５％体积分度ＣＯ２恒温培养箱中培养。第３天首次换液，以后每３ ｄ换液１次。至贴壁细胞融合达９０ ％以上，吸出培养液，ＰＢＳ洗３次，用２．５ ｇ／Ｌ胰酶（含１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）孵育消化２ ｍｉｎ，再加入等量含１００ ｍｌ／Ｌ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液终止消化，轻轻吹打使所有细胞脱落，收集细胞悬液，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ（ｒ＝１５ ｃｍ） 离心５ ｍｉｎ，弃上清液，用含１００ ｍｌ／Ｌ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液悬浮细胞，以１∶３的比例接种于２５ ｃｍ２的塑料培养瓶中，ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液（添加终浓度为２ ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺）传代培养，隔３ ｄ换液１次。传至第６代的ＭＳＣ接种在前一天涂有１００ μｇ／Ｌ多聚赖氨酸的塑料培养瓶或培养皿中，用含１００ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液添加１０ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ的培养液培养。
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１．２．２流式细胞仪检测诱导前ＭＳＣ的细胞表面抗原传至第６代的ＭＳＣ生长约９０％融合后，吸去培养基， ＰＢＳ洗３次， ２．５ ｇ／Ｌ胰酶消化２ ｍｉｎ，加入等量含１００ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液终止消化，轻轻吹打使所有细胞脱落，收集细胞悬液， １ ０００ ｒ／ｍｉｎ（ｒ＝１５ ｃｍ）离心５ ｍｉｎ，弃上清液，２０ ｍＬ／Ｌ冰甲醛固定３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤２遍后，加入流式细胞仪缓冲液，上流式细胞仪（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ， ＢＤ公司，ＵＳＡ）检测ＭＳＣ细胞表面抗原ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５，检测抗体见表１。
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# g3 @* D* |8 K# i １．２．３ＭＳＣ向神经元样细胞的定向分化将传至第６代的ＭＳＣ待贴壁细胞融合达８０％时，进行神经元细胞的定向诱导，诱导方法参照［１０］。预诱导：吸出培养液，加入含１００ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ和１０ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液进行预诱导２４ ｈ。神经元诱导：吸出培养液，用ＰＢＳ洗３次，加入含２０ ｍＬ／Ｌ ＤＭＳＯ， １０ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ， １００ μｍｏｌ／Ｌ ＢＨＡ，１０ μｍｏｌ／Ｌ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ ， ２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， ２ ｍｍｏｌ／Ｌ丙戊酸，５ μｇ／ｍＬ胰岛素的无血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２诱导剂，每２４ ｈ诱导剂半量换液。8 s# e/ ^( D/ P5 V0 y. e# n1 w
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１．２．４免疫荧光检测分别对３５ ｍｍ的塑料培养皿中培养的第６代ＭＳＣ及诱导后６ ｈ、１２ ｈ、２４ ｈ的细胞，用ＰＢＳ洗涤３次，以４０ ｇ／Ｌ多聚甲醛固定３０ ｍｉｎ，再以ＰＢＳ洗涤３次，在冰上１ ｍＬ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００透化２ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤３次，３０ ｍＬ／Ｌ Ｈ２Ｏ２封闭以消除内源性过氧化物酶，正常非免疫性３０ ｍＬ／Ｌ山羊血清封闭１ ｈ， ＰＢＳ 洗涤３次后分别滴加一抗，包括ｎｅｓｔｉｎ，ＧＦＡＰ，ＮＦ-２００，加ＰＢＳ作空白对照，４ ℃过夜，第２天取出后室温孵育１ ｈ，ＰＢＳ洗涤３次，分别加入羊抗兔荧光二抗３７ ℃避光孵育１ ｈ，ＰＢＳ洗涤３次，加入Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２，３７ ℃避光孵育１５ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤３次后荧光倒置显微镜下观察并用数码相机采集图像后利用Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ６１０软件进行叠加。机数取１０个非重叠视野（１００倍），计算总细胞数Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２（胞核发蓝色荧光）和ｎｅｓｔｉｎ、 ＮＦ-２００ 和ＧＦＡＰ阳性细胞（胞浆发红色荧光），计算阳性率，结果用均数±标准差表示。+ Q! |9 a1 `# V' o
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１．２．５统计学处理显著性检验采用两独立样本ｔ检验 （所有分析均使用ＳＰＳＳ统计软件包）。
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２ 结果+ Z2 Q6 f% _, ]" Q
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２．１ＭＳＣ的培养和纯化 A2 i+ B) v$ O; M' S
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骨髓细胞接种２４ ｈ后，可见少数细胞贴壁，随着时间延长，贴壁细胞增多，分布不均。第５天，细胞增殖迅速，以梭形为主，也可见一些多角形和大而圆的细胞散在或成行分布。细胞呈集落趋势生长，集落中心细胞体积变小，轮廓不清。接种８-９ ｄ ，细胞基本达９０％融合，此时行传代培养。传代后细胞生长潜伏期短，１２ ｈ即贴壁，增殖迅速，３ ～ ５ ｄ细胞即融合９０％。传代后细胞生长均匀，大部分呈长梭形或扁平，排列规则，表现为流线形或漩涡状生长。传至第６代，细胞形态基本一致，呈长梭形，漩涡状排列（图１）。
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２．２ＭＳＣ细胞表型& D" E$ D: _$ @% r7 c9 i% l
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流式细胞仪检测第６代ＭＳＣ表面抗原ＣＤ２９和ＣＤ４４阳性，ＣＤ３４和ＣＤ４５阴性，结果详见表１，其流式细胞仪检测见图２。* p6 o7 M# ~4 i1 M+ ^
6 |9 ?/ p- @6 o! d; j' F1 n3 a ２．３ＭＳＣ向神经元的定向诱导分化
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1 _9 X5 w" i+ g1 C* M 第６代ＭＳＣ诱导３０ ｍｉｎ后细胞形态发生明显改变，出现神经元样细胞。这些细胞胞体变小，胞质向核周收缩，由原来的梭形变成圆形，折光性增强，并且伸出类似神经元样突起，突起末端发出次级分支，突起与相邻细胞胞体或突起相连，形成网络样结构。随着时间延长，神经元样细胞增多。到第２４小时，９８．０％分化成神经元样细胞，有少量神经元样细胞漂浮死亡（图３）。
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8 j& W& I8 P5 H/ g5 b ２．４诱导后的神经元样细胞免疫荧光鉴定及阳性细胞计数9 S3 a! {7 C# S
$ t+ {# j# H$ L/ C$ y% ?: F* {8 p: j 第６代ＭＳＣ及诱导后行免疫荧光检测ｎｅｓｔｉｎ、ＮＦ-２００和ＧＦＡＰ表达。ＭＳＣ诱导前ｎｅｓｔｉｎ阳性率为５７．１％ ± ６．９％，诱导分化后６ ｈ，１２ ｈ，２４ ｈ阳性率分别为９６．５％ ± １．９％，８８．１％ ± ５．４％，３３．５％ ± ５．４％，ＭＳＣ诱导分化后６ ｈ与未诱导ＭＳＣ有显著差异（Ｐ ＜ ０．０１，图４）。诱导分化过程中ｎｅｓｔｉｎ呈一过性增加。诱导前ＮＦ-２００是阴性，经诱导分化后６ ｈ，１２ ｈ，２４ ｈ的神经元样细胞ＮＦ-２００阳性率随时间延长而增加，阳性率分别９０．１％ ± ２．９％，９７．５％ ± １．３％，９８．１％ ± １．６％。ＧＦＡＰ在诱导前和诱导后均不表达．对照组均无阳性表达（图５）。
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目前有关干细胞向神经元的诱导分化，主要采用多种细胞因子、基因转染以及化学诱导剂诱导的方法，但是前两者诱导时间长，获得神经元样细胞的百分率较低［９］。本实验中采用细胞因子ｂＦＧＦ和ＢＨＡ＋ＤＭＳＯ联合诱导方法，在经过了约１ ｈ的诱导后，约９５ ％的成年大鼠ＭＳＣ诱导分化为具有典型的神经元形态的细胞，图３。
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9 `- m8 x) {9 q Ｎｅｓｔｉｎ是一种中间丝蛋白，主要在神经元和神经胶质细胞的共同前体-神经干细胞表达［１１］。免疫荧光染色的方法检测用含１００ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液添加１０ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ的培养液培养的ＭＳＣ，ｎｅｓｔｉｎ呈阳性表达，而ＮＦ-２００和ＧＦＡＰ均为阴性．说明表达ｎｅｓｔｉｎ的ＭＳＣ是神经前体细胞。9 N+ {" ]8 ]; i d, E
+ o! |& J* X7 u% K$ t3 J ＦＧＦ是神经干细胞增殖分化的重要物质［１０］，在体内ＦＧＦ缺乏时， 神经发育障碍［１２］。最近对ＦＧＦ促进ＭＳＣ的增殖和分化进行了广泛的研究，如成骨，成脂及神经分化［１３-１６］。Ｓａｔｏｍｕｒａ 等［１７］利用ＤＮＡ测序方法检出ＭＳＣ表面存在ＥＧＦ受体（ＥＧＦＲ）、 ＦＧＦ 受体（ ＦＧＦＲ）、血小板衍生生长因子受体（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＤＧＦＲ），ＥＧＦ、ＰＤＧＦ可以促进ＭＳＣ的增殖，并且会诱导细胞内酪氨酸及ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ 磷酸化。当以上生长因子单独或联合作用于ＭＳＣ 时，可以与具有多向分化潜能的ＭＳＣ的表面受体结合，进一步激活一系列的胞内反应，促使骨髓间质干细胞向神经元样细胞横向分化。ｂＦＧＦ 的受体系统是双受体系统，有低、高亲和力受体。Ｔａｓｓｉ 等［１８，１９］，ｂＦＧＦ必须先与细胞表面低亲和力ｂＦＧＦ受体及胞外硫酸已酰肝素蛋白聚糖（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，ＨＳＰＧ） 结合，然后连接、激活细胞表面高亲和力ｂＦＧＦ受体，高亲和力ｂＦＧＦ受体出现二聚化和自磷酸化， 自磷酸化的ｂＦＧＦ受体顺次激活下游能与ｂＦＧＦ受体上ＳＨ２ 区结合的信号转导分子；而且，激活的ｂＦＧＦ受体被转接蛋白联接到Ｒａｓ／ＭＡＰＫ，完成细胞外信息向细胞内传递而发挥其生物学活性作用。在体外培养体系中，ｂＦＧＦ和组蛋白Ｈ１紧密结合，激活蛋白激酶ＣＫⅡ，参与不同的基因表达调控［２０］。本研究培养的表达ｎｅｓｔｉｎ的ＭＳＣ可能是多聚赖氨酸作用结果，是多聚赖氨酸调整或转换ＦＧＦ信号机制。$ n0 X3 x( q% \- f1 t: l5 t7 A
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实验观察到Ｎｅｓｔｉｎ阳性的ＭＳＣ诱导分化过程中一过性表达ｎｅｓｔｉｎ增加，从５７．１％ ± ６．９％到诱导６ ｈ ９８．５％ ± １．９％，以后随时间延长逐渐减低。说明其具有类似神经干细胞的特性．故可用于神经干细胞的鉴定［１１］。ＮＦ-２００是神经细胞成熟的标志，在正常情况下只存在于轴索中，而胞体不含或很少含有［２１］。本研究结果显示ＮＦ-２００在６ ｈ阳性率达９０％，１２ ｈ和２４ ｈ阳性率达９８ ％，ＧＦＡＰ是星形胶质细胞的特异性标志蛋白，实验中我们一直未发现ＧＦＡＰ阳性结果，提示ＭＳＣ向神经元方向分化，而不是向胶质细胞转化，这与Ｗｏｏｄｂｕｒｙ［６］的研究结果一致。以上结果提示ＭＳＣ在诱导过程中，蛋白分子的表达与神经元发育过程相同。因此，ＭＳＣ经细胞因子ｂＦＧＦ和ＢＨＡ ＋ ＤＭＳＯ联合诱导作用后，其神经细胞蛋白分子的表达顺序与神经干细胞分化成熟过程一致，且此种诱导方法可以在短时间内获得较高百分率的神经元样细胞。这为神经细胞的发育研究提供了一个较好的体外模型。值得注意的是，我们的研究从６ ｈ开始存在Ｎｅｓｔｉｎ和ＮＦ-２００的共同表达，提示神经元发育过程中存在早晚标志蛋白表达的交叉，不能仅凭一个成熟标志决定其是否分化成熟。
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# X0 L6 Z) v, F; b+ k ＭＳＣ以其自身的优势和向神经细胞分化的可塑性被认为是中枢神经系统疾病细胞治疗理想的种子细胞。但目前大多数ＭＳＣ移植实验中所使用的细胞都是未经诱导的［１３］，因为ＭＳＣ体外诱导分化后的细胞一般存活时间短，不能有效增殖，尚不能满足移植的需要。在体外培养了骨髓来源的神经祖细胞并成功的诱导了向神经元细胞的分化，表达ｎｅｓｔｉｎ的ＭＳＣ为今后ＭＳＣ移植治疗神经系统疾病提供新的细胞来源。 t* ^, P d7 A1 k, E: ]
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发表于 2009-3-3 12:38
发表于 2015-5-29 15:49
