小鼠骨髓MSC冻存和复苏问题

feiyang

大家有小鼠骨髓MSC冻存和复苏的具体protocol吗？消化后，吸出trypsin，再加含血清的培养液中止消化，然后直接加入10％DMSO分装冻存管吗？一管放多少细胞合适啊？复苏过程如何呢？谢谢大家了！

痞子的烟头

冻存跟其它细胞是一样的，百分二十或四十血清，百分十DMSO，至于放多少细胞，这个按传代比例放就可以了，复苏都一样；我以前是这样操作；

luoziwei

消化吹打后离心，1000rpm/min，5min，制成细胞悬浮液，然后冻存管分装。一般T-25瓶子长满的话可以分两管，然后就是梯度降温保存过程（4°（30min)—— -20°（60min)—— -80°（过夜）——液氮）

小熊不杀生

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我们用的冻存液是DMSO占10%，然后依次温度递减（4°--负20°--负80°--液氮保存），我记得老师教的是：慢冻快融。复苏的时候先备好37℃温水，然后再融细胞，祝你能成功。

feiyang

谢谢大家！我还有问题：1.消化下来的细胞离心后直接加入冻存液分装，还是离心后再用PBS洗一遍再加入冻存液分装。2.75cm2的培养瓶80％融合的细胞，分3－4管合适吗？

sydfxt

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不用再洗了,离心多了影响细胞活性,你这个量分3管没问题

feiyang

谢谢大家的指点！

色色兔

DMSO 0.1ML, 血清0.5ML，培养基0.4ML。先加血清溶细胞，再把剩下的加进去，边加边摇

清影

回复 feiyang 的帖子3 d: k9 J! I5 @5 O6 r( d
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消化下来的细胞不用离心了，计数后，以106/ml加入15%FBS+8%DMSO冻存液重悬细胞，混匀，分装冻存管后放到冻存盒内后-80，24h再转入液氮或者直接液氮中程序降温，或者4°--负20°--负80°--液氮保存。
3 `$ C% t5 p+ H9 g解冻细胞37度迅速复溶，基础培养基重悬后，1100rpm,8min,l离心收集细胞，以合适密度用完全培养基重悬细胞，混匀，接种即可（DMSO对细胞有一定毒性，最好离心）

309208770

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  I% K( w6 G  ^$ k; L, T3 M洗一遍