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作者：周长华作者单位：510317 广东广州，广东省第二人民医院血液科 4 H4 H. X3 ?4 s& h. u% [, W: x; K
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s; h5 n# B, Y$ h# g1 i5 [9 A 【摘要】 目的 探讨正常供者与恶性血液病患者使用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员后，用血细胞分离机采集的外周血造血干细胞通过形态学,观察PBSC中淋巴细胞比例及单个核细胞活力。方法 分别对10例正常供者和7例恶性血液病患者使用G-CSF动员剂，用血细胞分离机采集外周血中单个核细胞（MNC），观察有核细胞数、有核细胞分类、MNC计数及细胞活力。结果 使用G-CSF动员后正常供者组有核细胞总数为（4.25±1.61） ×108/kg， MNC为（96.5±5.2）%、MNC分类中淋巴细胞占（67.3±10.5）%、粒细胞占（16.1±9.0）%、单核细胞占（16.5±4.0）% ，冻存前后细胞活力分别为（91.4±4.7 ）%、（67.1±8.9）%，；恶性血液病组有核细胞总数为（6.18±4.46）×108/kg，MNC为（92.1±15.9）%，冻存前后细胞活力分别为（83.7±10.7）%、（56.2±19.6）%。结论 单用G-CSF或化疗联合G-CSF动员均可采集到足够数量的外周血造血干细胞，应用淋巴细胞乘以有核细胞数作为外周血造血干细胞移植时计算输入外周血造血干细胞数量的指标时简便、快捷，不失为一良好的临床检测方法。
5 Y, v! }' t1 E1 v. W" ?. n4 E8 s 【关键词】 粒细胞集落刺激因子；外周血造血干细胞；单个核细胞3 k2 W! F9 V& O
外周血造血干细胞移植（PBSCT）是根治恶性血液病的惟一方法。在临床中常利用血细胞分离机收集外周血造血干细胞（PBSC）,被收集的外周血造血干细胞与其他的单个核细胞混在一起，包括部分淋巴细胞、单核细胞及幼稚粒细胞［1］。关于干细胞的形态，目前认为不能在显微镜下鉴别采集的单个核细胞中某些细胞是或不是造血干细胞，多数人认为其镜下形态与淋巴相似，在日常工作中被混在淋巴细胞中［2］。在临床实践中常以单个核细胞（MNC）数作为收集、输入外周血造血干细胞数量的判断指标。笔者把形态学不可辨认的干细胞归入淋巴细胞比例中，探讨异基因与自体外周血造血干细胞移植分离的PBSC中淋巴细胞的含量，对10例正常供者和7例恶性血液病患者经使用G-CSF动员后用血细胞分离机采集的外周血造血干细胞通过形态学,观察PBSC中淋巴细胞比例及单个核细胞活力进行了观察，现将结果报告如下。) q1 \9 d$ h: D: O9 N6 N' P$ u
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1 资料与方法& \% J. |1 B" G9 Y
' ^$ O5 |% W* |8 e4 S+ L% |* D1.1 一般资料 正常供者组10例，男8例，女2例；年龄6～40岁。恶性血液病患者组7例，男3例，女4例；年龄18～59岁；其中急性淋巴细胞白血病2例，急性早幼粒细胞白血病1例，非霍奇金淋巴瘤3例，霍奇金淋巴瘤1例。
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1.2 方法
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1.2.1 外周血造血干细胞的动员和采集 正常供者组外周血造血干细胞动员均单用细胞因子动员，皮下注射G-CSF（惠尔血）5μg/（kg·d），连续给药4天后开始采集，用血细胞分离机（广州市血液中心仪器）采集PBSC，采集终点量按单个核细胞达到（4～6）108/ kg，每天采集1次，采集2～3次/例。恶性血液病组动员均采用化疗加细胞因子联合动员，化疗：阿糖胞苷（Ara-C）2.0m2/d4天，动员后待白细胞数下降至1.0109/L以下时，皮下注射G-CSF 5μg/（kg·d），待白细胞回升至4.0109/L以上时，用血细胞分离机采集PBSC，采集2～3次/例。
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7 O: ^' w7 w, q; ]3 u) |6 u; |1.2.2 外周血造血干细胞的保存 采集正常供者的造血干细胞按移植所需单个核细胞数输入受者体内，余下细胞按（1～4）108/ml细胞浓度，在超净台中分装入深低温冷冻袋，再加入终浓度含10%二甲亚砜的人AB型血浆，充分混匀后排气封口，放入RBC-97型程控降温仪内，采用1℃/min的降温速度冷冻至-80℃后，立即移入液氮中保存。恶性血液病患者的造血干细胞保存用自身血浆代人AB型血浆，其余操作按正常供者组的要求操作。
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1.2.3 MNC质量检测 用血细胞分析仪检测正常供者和恶性血液病患者动员后采集的PBSC中的有核细胞计数，取样涂片做瑞氏-吉姆萨混合染色，显微镜镜下分类计数1000个有核细胞，记录单个核细胞比值，并计算淋巴细胞百分比。冻存前后用0.5%台盼蓝染色，计数1000个有核细胞，观察细胞活力百分比［2］。9 Y: q% C# ]- P# Z' Y. \) {
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1.3 统计学处理 数据以x±s表示，组内比较采用t检验。
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2 结果* o# c8 S6 q, O+ q- b; U
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2.1 外周血MNC分离 正常供者组采集的PBSC有核细胞总数为（4.25±1.61）108/ kg，恶性血液病患者组有核细胞总数MNC数为（6.18±4.46）108/kg。恶性血液病组采集的PBSC有核细胞数高于供者组（P
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2.2 单个核细胞计数及分类 正常供者组MNC计数为（96.5±5.2）%，其中淋巴细胞占（67.3±10.5）%、粒细胞占（16.1±9.0）%、单核细胞占（16.5±4.0）%；恶性血液病组MNC计数为（92.1±15.9）%，其中淋巴细胞占（57.3±17.7）%、粒细胞占（29.2±16.2）%、单核细胞占（13.5±8.6）%。
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' x, D6 b' B. Y' d1 s7 i5 o) t4 O2.3 冻存前后单个核细胞活力 正常供者组冻存前后细胞活力分别为（91.4±4.7 ）%、（67.1±8.9）%，恶性血液病组冻存前后细胞活力分别为（83.7±10.7）%、（56.2±19.6）%。两组冻存前后细胞活力差异均有显著性（P# X$ c* W9 q9 X
m3 }& S0 [ U8 [9 d 3 讨论& u" X9 ~9 y7 p8 t, x$ w/ ?. x
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外周血造血干细胞移植已成为治疗部分恶性实体瘤及白血病的主要手段之一。外周血造血干细胞的动员方案多种多样，目前临床中常用化学药物、造血干细胞集落刺激因子或化学药物加造血干细胞集落刺激因子。本文中做异基因外周血造血干细胞移植时，正常供者采用的是单独用G-CSF作为动员剂, 皮下注射G-CSF 4天后逐日采集外周血造血干细胞；自体外周血干细胞移植时，恶性血液病患者常用大剂量化疗药物加G-CSF作为造血干细胞动员剂，待白细胞升至4.0109/L以上开始采集造血干细胞。两组采集的外周血造血干细胞数量均可满足移植后完成造血重建的要求。
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: V1 m9 j7 e5 v$ h( q* {; B2 Z- p5 HG-CSF可促使骨髓及外周血粒系数量显著增加和发生核左移。笔者通过细胞形态学观察收集的外周血造血干细胞发现其中含有淋巴、单核、早幼粒、中幼粒、晚幼粒及成熟粒细胞，收集的17例外周血单个核细胞均以淋巴细胞为主，每例均可见单核细胞，10例正常供者组中有6例出现幼稚粒细胞，而恶性血液病患者组7例均见幼稚粒细胞，并且幼粒细胞比例明显高于供者组。可能是恶性血液病患者经强烈化疗后，骨髓血液屏障遭到破坏致使未成熟细胞更易释放到外周血［3］。由于形态上可辨认的幼稚粒细胞及成熟粒、单核细胞数量较多，加上冷冻损伤主要为成熟细胞，因此，冻存后的细胞活力均较冻存前低。本文正常供者组与恶性血液病组两组外周血造血干细胞冻存前后细胞活力均有明显差异，冻存后的细胞活力与文献［4］报道-196℃液氮中保存细胞的存活率只有60%左右比较相近、与分类时淋巴细胞所占比例比较一致。笔者认为，在临床实践中行外周血造血干细胞移植时，用淋巴细胞比值乘以有核细胞总数计算单个核细胞数作为计算移植时输入外周血造血干细胞数量的判断指标，较用所有单个核细胞总和更有实用价值，能更好地为临床提供有价值的数据依据。& d4 W# {7 v8 a! I. a2 T% x0 U
【参考文献】
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/ i1 X& O4 _: t% x( h: k 2 卢圣栋.现代分子生物学实验技术，第2版.北京:中国协和医科大学出版社,1999，443-444.
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0 d. h4 Q* ~; M, p0 G( E% Q! t 4 梁辉.自身外周血造血干细胞移植.国外医学·儿科学分册,1994,21（2）：64-67. |
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发表于 2009-3-3 12:38
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