STR-PCR半定量检测嵌合体方法在非清髓异基因造血干细胞移植中的应用

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作者：熊辉霞  陈宝安作者单位：（1．青海大学附属医院；2．东南大学附属中大医院）
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          【摘要】  目的  应用STR-PCR半定量嵌合体检测方法监测非清髓异基因造血干细胞移植（non-myeloablative allogeneic stem cell tansplantation，NAST）后嵌合体。方法  采用短串联重复序列-聚合酶链反应（STR-PCR）结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色以及凝胶成像分析技术对28例接受NAST的患者进行嵌合体监测。结果  27例患者形成造血细胞嵌合体，完全嵌合（complete chimerism，CC）22例，混合嵌合（mixed chimerism，MC）5例；其中低比例嵌合（low level of mixed chimerism，LMC）3例，高比例嵌合（high level of mixed chimerism，HMC）2例。稳定植入的患者 7天即达HMC，3例患者复发前检测到供体细胞嵌合率（donor cell，DC）下降，1例在CC状态下复发，1例LMC发生早期移植排斥，长期存活者均保持稳定CC。嵌合体监测下早期接受临床干预治疗的MC患者转化为CC并延长了无病生存期。结论  STR-PCR是一种简单、敏感、经济的监测非清髓移植后嵌合体的方法。        熊辉霞（1977～），女，汉族，青海籍，主治医师，硕士
- A' O7 A5 v5 k  C% S) y' y          【关键词】短串联重复序列  非清髓造血干细胞移植  造血嵌合体3 d* w: M; J* |* w4 W
                  SEMI-QUANTITATIVE ANALYSIS OF CHIMERISM AFTER
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NON-MYELOABLATIVE ALLOGENEIC STEM CELL
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TRANSPLANTATION BY STR-PCR
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Xiong Huixia1，Chen Baoan2
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2. The Affiliated Zhongda Hospital of Southeast University）
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5 _5 K- V# _4 n2 E9 ~1 mAbstractObjectiveTo investigate the value of semi-quantitative analysis of chimerism after non-myeloablative allogeneic stem cell tansplantation(NAST) by short tandem repeat-polymerase chain reaction(STR-PCR).Methods 28 patients received NAST were evaluated. Semi-quantitative assessment of hematopoietic chimerism was performed by STR-PCR, polyacrylamide gels, silver staining and detected by Image Analysis System. Results 27 cases formed hematopoietic chimerism, 22 cases formed complete chimerism(CC) and 5 cases were of mixed chimerism(MC), 3 cases formed low level of mixed chimerism(LMC) and 2 cases were high level of mixed chimerism(HMC). Patients with stable engraftments showed HMC on day  7. Before the time of relapse, STR-PCR indicated decrease of donor cell(DC) in 3 patients. One patient relapsed in CC status and another patient with LMC rejected grafts earlier. Patients with persistent CC were associated with a longer disease-free time. Patients received an early intervention of clinical treatment transferred from MC to CC or got a longer disease-free time. ConclusionSTR-PCR provide a simple, sensitive and economic approach for monitoring of chimerism after transplantation./ ?- Z9 F( M* B
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Key wordsshort tandem repeatsNon-myeloablative stem cell transplantationNematopoietic chimerism8 \- h- E, c' K  K4 v- l# K% r
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非清髓异基因造血干细胞移植（NAST）由于减量的放、化疗预处理加上强效的免疫抑制，移植后多形成供、受体细胞不同比例的混合嵌合体，并呈动态变化［1, 2］。嵌合体监测对分析植入状态，判断疾病复发及指导移植后续治疗具有重要意义。短串联重复序列（STR）是目前检测嵌合体最常用的遗传标记，我们采用STR-PCR半定量方法对28例接受NAST的患者进行了嵌合体的检测，现报告如下。# b: w# N1 s" ]/ k* c7 m# W* v

/ S$ v; X2 `# o7 n# h1资料与方法
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0 g% Y4 R: F" q* |8 H, z1.1病例资料  ^( C6 f" c9 m
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观察对象为2003年至2005年在东南大学附属中大医院血液科接受NAST的患者28例，男19例，女9例，年龄15岁～58岁，中位年龄37岁。其中慢性粒细胞白血病（CML）19例，慢性淋巴细胞白血病(CLL)1例，急性非淋巴细胞白血病(AML)3例，骨髓增生异常综合征(MDS)4例，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)1例。同胞供者24例，无血缘关系供者2例, HLA配型均为全相合；单倍型亲缘供者2例，均为DR位点不合。供、受者性别相合18例，性别不合10例。ABO血型相合21例，血型不合7例。) T8 t1 x! Z- O1 M3 \
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1.2方法' D6 k( b. T# I% M

9 ^5 D! @: d7 U8 v. A1.2.1标本收集和处理  |# j0 i" T' [# B9 P  J+ L5 C7 O
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术前采集供者和受者外周血2 ml，术后 7天、 14天、 21天、 30天采集患者外周血，此后据患者随访时间采集外周血每月1次或每3月1次。行供体淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusion，DLI）治疗后每15天采集受者外周血1次，直至可评价的终点。移植后早期造血抑制期每次抽血5 ml，此后每次2 ml，ACD抗凝，于采血后24 h内用红细胞裂解液裂解红细胞，提取白细胞，用Chelex-100法快速提取基因组DNA，编号后置-20℃冰箱保存。
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1.2.2STR基因座的选择
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' x8 s- x3 K  F& ~7 ^0 V本研究选择STR位点的原则是：均为四碱基重复序列（错配较少）；杂合度较高（有较高的个体识别能力）；等位基因个数适中，平均6～10个（易于分型）；等位基因频率在研究人群所属地区分布较好。按文献［3, 4］选择D5S818、D13S317、D3S1358、D8S1179、D7S820、D16S539、FGA、vWA 8个位点进行检测。! f+ {5 z, S) o$ w( o0 C9 H+ }, ]  ?8 q

" Y- x. W- w+ P% U% \- V  d% A1.2.3嵌合体检测
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, [" V0 s% B- ~先对供、受者术前标本在上述8个位点进行扩增，对扩增产物行非连续非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色显影，根据等位基因阶梯（Ladder）对照阅读各位点的基因型, 找出各组供、受体可区分彼此的有信息位点，按Thiede等［5］报告的方法进行分类，选择出Ⅰ类和Ⅱ类位点，术后标本仅在Ⅰ类和Ⅱ类位点扩增，凝胶用UVP成像分析系统进行灰度扫描后用Gel-Pro 4.0软件分析，选择相应的公式以整合光密度（IOD）值计算供体细胞嵌合率（DC）。/ H* j* p4 H2 v( f" z
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1.2.4嵌合体的界定［6］6 t, j+ w; V. a

) F! B$ ^) m% l* j0 M5 G完全嵌合体（CC）：DC＞95%；混合嵌合体（MC）：5%＜DC＜95%；高比例嵌合体（HMC）：DC≥50%；低比例嵌合体（LMC）：DC≤50%。
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2结果* h/ y- g% A! Y2 }; R) W8 O
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移植1个月后，28例患者中仅1例MDS-RA患者未检测到嵌合体，造血始终未恢复，ANC＜0.1109/L ，骨髓增生极度减低，证明移植失败，于移植后45天死于严重感染。余27例患者均形成不同比例的供、受者造血细胞嵌合体，其中22例形成CC；5例形成MC；2例形成高比例混合嵌合（HMC）；3例低比例混合嵌合（LMC）。所有稳定植入的患者在 7天时的平均嵌合率是74.71%，此时尚处于造血抑制期， 14天多数病例达CC，平均嵌合率是95.74%。移植后随访1.5月～27月，平均11个月，22例CC患者中3例患者复发前检测到DC下降，1例在CC状态下复发，长期存活者均保持稳定CC。5例MC患者中，1例LMC的CLL患者早期出现移植排斥， 1月时STR-PCR检查仅在vWA、D7S820、D5S818位点检测到少量的供者型遗传标记（DC为27%），但血常规检查提示造血恢复，考虑为早期移植排斥，自身造血恢复，经2次DLI后逐渐达到CC，并保持稳定CC（见图1）；另2例LMC患者早期复发，1例死亡，1例经二次标准移植后获得CC。2例HMC患者中的1例为CML，移植后1月即为MC（DC为54%），及时予DLI 1次，DLI后 1.5月时已有治疗反应，DC上升到80%，出院后患者未能继续监测嵌合体， 4月时出现遗传学复发（Ph阳性染色体占90%），再次入院，予DLI 1次，疗效不佳，迅速出现血液学复发，嵌合体检测为完全受者型（见图2）。另1例HMC患者 1月后进行性下降，脾肿大，骨髓增生明显活跃，诊断为脾功能亢进，STR-PCR检查持续MC，DLI后未见DC上升， 4月时行脾切除治疗， 8月时转为CC，并保持稳定CC。7 k6 V' R& A. S. Q" w/ o0 |2 \

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STR是一类呈高度多态性的遗传标记，STR-PCR技术灵敏、快速，是目前最常用的检测嵌合体的方法之一［7］。国内外有多家移植单位采用荧光标记的多重PCR结合DNA测序仪和基因扫描软件程序检测嵌合体，虽然具有自动化程度高、无交叉污染、省时快速等优点，但由于多个位点在同一反应管内扩增，其敏感性阈值较单一位点STR-PCR方法的敏感性低，并且对仪器设备要求高，长期监测费用昂贵，国内难以普及。我们采用STR-PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色以及凝胶成像分析技术检测嵌合体的方法，首先筛选出能区别供、受体的有信息的位点，并进一步找出敏感性较高的分析位点，在移植后嵌合体的长期监测中，我们只需选择对供受者适合的少数位点进行检测即可反映足够的临床信息，并且不需特殊的试剂仪器，简便易行。同时我们还发现，微卫星位点的选择十分重要，并非所有的信息位点都适合于嵌合体的定量检测，有些位点在定性分析时有意义，但在定量分析时意义有限。嵌合体检测的目的主要是在以供者细胞为前提的条件下发现受者细胞，影响定量分析结果的一个重要因素是等位基因的长度。由于PCR时存在以下两种现象影响扩增效率的一致性：（1）短片段优先扩增；（2）平台效应。因此，在选择分析位点时，应满足受者等位基因长度小于供者等位基因长度。同时我们进一步发现，如果目的基因是纯合子，则检测的敏感性更高。但在实际应用中，如果患者和供者的血缘关系非常近，有可能找不到符合上述条件的STR位点，就不得不选择一些敏感性较次的位点。
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0 t- p( x- p& }我们的研究发现植入成功的患者在 14天多数达CC，在之后的随访中，凡长期存活的病例都能保持稳定CC，5例MC均不稳定，有DC进一步下降导致移植排斥和复发的倾向。此结果提示早期供体植入率是影响NAST能否发生移植排斥的重要因素，  100天内更应加强嵌合体监测并及时采取预防措施。STR-PCR技术可在严重粒细胞缺乏阶段实施，嵌合体检测虽然不能直接检测出残留的白血病细胞，但由于受体细胞比例增加与移植排斥和复发的危险性高度相关［8,9］，因此可通过定量检测供体细胞嵌合率，来判断患者体内残留的受体细胞水平。DLI是移植后临床干预治疗的重要组成部分，其诱导的移植物抗白血病效应（graft versus leukemia effect，GVL）在肿瘤细胞负荷低时易发挥根治性作用，把握DLI的时机和数量是取得较好疗效的关键。STR-PCR通过定量检测DC的消长趋势，可以确定实施DLI的时机和强度，判断DLI的疗效，尤其适用于无特异性肿瘤标志基因异常的恶性血液病患者［10］。# {& R2 P1 L5 h' o
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因此，我们认为，在移植后嵌合体的长期监测中，STR-PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色以及凝胶成像分析半定量检测嵌合体的方法是一种简单、敏感、经济的监测方法。7 X4 ?+ s# d3 C1 v8 F
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