大家看看小鼠ES细胞集落是这样的吗？我是新手，又刚养细胞，谢谢了。

syl82

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2 J# m7 x/ T6 H! V小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
& k- M3 k& \1 ?1 @, O# _胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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3 K+ G/ ~% A: F" h. [在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 & S" s. b2 E0 T3 V6 z
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 $ ]+ t1 A  l: @) ]1 W8 e% |
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 8 \2 v, x9 s  n2 Y5 I3 M3 w. i. `
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
- X2 b  ?; e* Q* k  ?9 u. v6 ~' d滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 ( o2 V, r, Z" `1 V
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 2 ~. \: {2 u5 ~4 ^2 @" v" X7 D. x
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
# Z. Y- |/ b3 D; x0 q用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 + V& O$ U# ^4 S" S- M
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）
0 ?1 M6 P( T- x# C9 H一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
& O9 a% o: r% W3 |! ~小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
& E7 a- h; w9 Z6 J4 M, [3 w在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
8 O2 |/ G0 S6 R: s3 ]9 y把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
# |0 Y* S" o1 p6 l吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
+ Z7 i: `! A0 C' D7 k- ]: A根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 ; k& c' s- p5 v2 ~" n. t) d
小鼠胚胎干细胞的传代
& t, l' h6 f8 K8 |* {吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 1 P8 P, ?7 s" y
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
3 M/ f# ~* c4 b2 n* [9 e+ }去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 6 M2 ^6 I7 U+ h+ q/ W0 i* k% @