大家看看小鼠ES细胞集落是这样的吗？我是新手，又刚养细胞，谢谢了。

syl82

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: C' v, H+ S& `$ J! @* G小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 , @9 a8 [. ~! }" f) {+ a
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 3 k3 n8 r6 }0 g: H+ O
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
! q6 f0 ]: q  I" x3 o. L; d! h; Q吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
3 A, o5 F* {  Y" J  q4 v& H' B根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
1 e' d6 Y; ]* c滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 5 a; R- I3 A4 \! d  F
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 ' u& U4 F; d. ]- P  \
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
  E$ L0 ^1 D4 A3 b& U4 i8 \- l用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
4 M9 W4 R0 ~2 ^8 F5 X/ I去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） $ ~  P! E2 L" @
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
% U2 u: ~% z4 M2 {( I6 s小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
: S  f# V. \5 J) L在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
- {9 ?5 [" s* Z9 e2 o  T把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
& y( J8 S/ D; ~9 ]/ R' T& Z吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 , g* R9 e) Y+ {$ Z" h7 P: D
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 8 {3 D( D2 Q4 U# O/ Z
小鼠胚胎干细胞的传代
! ]& A/ s/ _: }! @) k+ w/ K, ^/ g  ~吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 ; J# W" V# z6 F& Z- [
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
% l+ q8 u8 {+ ^4 ^/ X' h9 V去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
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