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也就是亚硫酸盐测序法，关键是设计好PCR的引物，一般为两轮的巢式PCR，甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。
) [' f; e3 L1 U/ b# K" j+ v第一部分 基因组DNA的提取。
- u% a3 V/ m$ Y7 Z* G这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。% b ]# Y- y9 Y( e
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。" l7 a1 W0 \4 y8 o3 B3 j- y
使用两者的细节：0 r, l6 p! S* X
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
* A( C6 K+ N! Y8 l5 U2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。: \3 Z) h, k1 E: Z
验证提取DNA的纯度的方法有二：
; T( u7 I+ G6 C+ }2 E0 X* Z& d5 [1 g1：紫外分光光度计计算OD比值；7 c: H. v! j' X' }& x: p7 Q
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
8 T- [- f% f6 ~" s9 M我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。, B* k" e ^( P9 A
/ x7 p) \: g4 y- V3 A第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA % k: `- Y5 n2 j5 x. b
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
3 D/ E z5 Z/ O2 b/ g$ A1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；+ b( u# I I3 Y3 d) p# i
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； , ]" f/ m% r8 C% ]# R5 w
3： 42℃水浴30min；, x0 G* Z/ c; B" M+ h0 d
水浴期间配制：; K+ E0 e3 e8 j8 R
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
' u. d+ r, Z( \7 [" o* E5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。1 ^' h* n( p l& ? y+ E0 h' k* q5 d
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
6 ?4 K& G* y& o5 S& F" k7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
% S' C, }2 V5 W- {* @5 u9 z8：50℃避光水浴16h。0 N1 I4 _$ U. D
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。2 z- E0 N' X5 [
这一步细节：# D- Z2 F; S1 s9 B/ J! c, v
1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
7 X% n9 ]" b( |" @) X5 c2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。( R$ U" P( H% k0 m" m4 p5 \- d8 a
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
3 K! h2 M* d+ j4 J4 l4 x/ \4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。
/ H" \3 t! ]. p: N* b0 m) C d( [; p" D2 z d; V5 t- A& _
第三部分 修饰后DNA纯化回收1 G# l8 P% f9 B/ r/ x8 h5 ?5 p* ?
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
$ T7 n+ v" V' [& J8 [1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。$ s, J C+ p) @" V9 y
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
$ F' ]2 g& q0 N6 q! h( c2 E' x1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；8 j! a" ^* K- d; X8 w- c) {
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；: b6 l- B) |/ g4 D; h7 Z' |% u
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
% N& C; M, h. `0 g9 Q& [4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。
9 U+ @" A5 F+ D$ i( a# F5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
$ i0 x7 W) T5 j6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。! ~6 c' `" W7 s( e
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。
) i5 t2 @$ }3 g& Y$ N$ w3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
3 Q* S1 u& d9 C8 X0 u; t3 G4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。
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3 {* h) |) A2 f/ Q8 s( L& }. Q5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。3 L. B k5 O8 G
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）" T+ Q; X3 F$ Q8 T5 d+ r% O
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。% N0 p/ m6 f- q7 `
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。
3 C- O5 m; @8 U6 Q5 U! n; s0 T' `9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。& O: F" g9 v! ^6 I9 g/ j
10：-20℃保存DNA溶液。
- y6 ~ ?3 B" R* Y9 u* Y
3 N# G) j3 }1 I. @( M+ p此步细节：& d" N( R2 _( Z
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。$ I$ A9 T0 L$ n! m
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。
+ N( I6 h9 m, g% q3 l3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。2 @' ?: z: R, }4 V6 {- q7 G
此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。4 Y# j. t) _1 N# O5 s+ h
. |6 }5 o0 A) H& V7 a* W3 m: h; B第四部分 修饰后DNA用于PCR6 r9 G& ~# K0 p2 d1 M
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
: V7 Q4 B7 f% z( k1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。2 U% s" f- ~8 }8 A
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。" C T( V8 }( [# K/ W
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。0 J6 I- ^/ l4 E+ q* J
4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。
7 }2 g$ c3 E9 E4 ?; E( V5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。: x1 l, U, O' w
这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分。
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% Z1 [8 {) T6 m: v \, O& j+ d第五部分 PCR产物的凝胶回收# A% _' Z# r5 {+ z
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。
, f, w' C/ x, |$ S) M: @) r9 t几个细节：
* T* Z( b" b2 E0 f8 c1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
8 T5 [- f- j: u: w- E* Y* H$ B2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。0 ?8 G3 l% K3 S) r) E0 e; Q$ }
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
4 h# Q1 u1 z2 p$ ^! v5 m- A4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。
8 d" S' m( ^' M5 I: y
% I% z! t* {/ C v' y2 j& f0 J第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
- _2 Y& O a: t, H; m: @" w& ?1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）* m4 P H) e) C# A
15ul体系9 G1 E) O. f% K3 Z
T-easy 1ul
7 [! ?1 |3 a6 vLigase 1ul
$ e! z8 p# W: Y+ p G3 T% {% w1 b0 c2xbuffer 7.5ul
. d5 @' X3 Q; h' K! f& \0 \DNA 5.5ul" _, x: ^; @( X8 T; D( ~. Z
4度，过夜。
' Q+ X! {3 ]$ N% P# }- _2：连接产物的转化! _& R& s1 S/ N
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
1 s3 t( W7 j0 R8 C2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；9 S( c: s. h3 ~' n% G
3）42度， 90秒钟；4 C) g, O) {3 M% H# m
4）冰上2分钟；
- H# z! H. w% W$ o, H/ O$ B( C5）800ul LB培养基；7 p/ z2 h& r a- H% G1 a
6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；6 p) h& K; o2 Z! Q7 U
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
2 F2 m# D% t& G. v8 ?0 T8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
5 {% u) B" u# A先涂：X-gar 35ul
" }1 G% ~$ s/ V6 I) c2 mIPTG 25ul L7 P2 e5 K% X( B2 r
后涂：混悬液 ) H6 u) I+ H" \& G
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。; `$ C% H) B% y& F: L& i
3：取白斑，划种于新板上! Z! ^7 w4 w$ y- o
新板：先涂：X-gar 35ul
" q; x3 f/ j/ i5 v3 i8 Y# iIPTG 25ul 5 t1 z3 J3 Y9 Q
然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。
8 _" ?: r1 [& t% ~% N针头挑白斑划2道于板上相应区域内。
& U, V% o: d; n37度，孵箱过夜。
* O# h$ a/ Q' N5 [4 i: ^ b# l) K# C4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。! x$ [* D/ E9 G7 R3 R) Z- @* L, g
" o' ~4 `( m7 t9 C8 f7 T
这一部分的细节：
+ M6 K$ h1 w w! t' F: Z1 ?* s. }$ J1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
( b8 S4 J5 w- L9 v; U- o2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。4 k2 M$ T+ w. o# a3 i3 U
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发表于 2010-12-25 14:56
