MSC的RNA提取问题

湘山山

最近做MSC方面的实验，用的是原代骨髓细胞题壁法培养，传到第3代细胞用来提取RNA，用的是QIAGEN的试剂盒（两千好几的试剂盒呀），逆转录用的是天根的，转录成cDNA后跑电泳发现不好，有的像降解的条带，有些干脆没有，真是郁闷呀。平时我们用QIAGEN抽取骨髓细胞RNA都还不错，不知道什么原因？大伙做过的聊聊，不胜感激，很急呀。。。

luoziwei

做RNA提取本身要求就比较严格，除了按照protocal,本身还需有良好的操作习惯，否则极易受到污染或者降解，导致产物偏低或者不纯。至于扩增阶段，牵涉到的东西很多，如样品量，引物，PCR条件，电泳条件等等，能给你的建议就是不要认为别人做的好，你用同一批试剂自己提取就是好的，自己多做几次，慢慢总结，相信你会提高的

chb611301

RNA比较脆弱，容易降解，所以提取RNA用的所有的EP管、枪头都要用DEPC水处理过夜，在高压后使用。只要这些提取细节注意了，用不着用QIAGEN的试剂盒，我们都用的是国产的试剂进行提取，逆转录就是用天跟的，也便宜，效果蛮好的。就像楼上说的，注意PCR的条件，你扩内参了吗，如果内参有，可能是你目的片段的引物问题或PCR条件问题，一个个排除吧！
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xiao6tao

我们RNA时特别小心，枪头及枪全部消毒，在超净工作台，每次效果都很好！戴口罩，师兄说提RNA不要说话，容易影响1

carolshen

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: z+ x" ~) b; t3 i你将cDNA跑电泳？貌似应该先跑个PCR吧，你只做了RT，PCR还没做呢？那样跑出来肯定很多条带了，你提取的是总RNA，反转录产物应是总RNA的complementary DNA而已。需要继续用特异性的引物，以cDNA为模板……+ v- y6 `4 {% J  r3 n
当然我说的可能和楼主的做法不一样，只提供下本人的一点看法……

湘山山

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& o; s/ \0 E4 Y/ `8 m+ f$ H& d' C( c. T1 K1 r2 f8 e
谢谢，我再试试。其实我做骨髓细胞RNA提取也蛮久了的，但每次也都有20-30%的标本提取得不好，我师姐比我做得要好。这次做MSC的RNA提取，8个标本都不好，所以我就怀疑是不是试剂盒合不合适的问题。

湘山山

回复 chb611301 的帖子1 L) C! a. K; R8 V* L, t! L
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我们用这些cDNA做荧光定量，内参及目的基因是有表达的，但峰值不太一致。因为这个目的基因以前做过，条件应该没什么问题，所以还是怀疑cDNA的问题。

湘山山

回复 xiao6tao 的帖子9 d  M8 U% D5 `5 V1 l& w3 O

( ^$ ~5 f+ Y! I8 X9 f2 P我们条件可能没那么好，我在做RNA提取，经常还有其他人在旁边做其他事情，说话更加了。但枪头都是无菌无酶的，也带口罩，冰盒操作。尽量避免吧，谢谢。

zhanglei1414

超净工作台，不开风机，帽子口罩，一次性手套勤换，注意操作，提完马上做反转，够你从下午忙到晚上的，东西都买无RNA酶的

湘山山

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  g' a9 {8 o6 K) e2 F8 F/ C呵呵，谢谢大家。我再补充一点，现在抽提RNA有专门血细胞的、组织细胞的、细菌的，我在想我用抽提血细胞的试剂盒抽提培养的MSC是否正确？培养的这些MSC是不是应该属于组织细胞类的呢？