大家把各自做EB的protocol发上来吧！！！

igdb

最近做EB，老是出问题，细胞大量死亡，形成的EB球很少。。) [" J# M; H: I$ _2 u2 G
/ a& u3 @+ j0 X# X$ ~
我一般是一个60mm 的ES长满后，差速贴壁去feeder，接种在一个60mm的细菌培养皿上，20%FBS HD培养基（无LIF），3ml培养基静置培养，两天换一次液。$ H! i. p, f1 A( R0 I

+ h* @7 G% b6 y+ Y! ~7 m   还有大家换液是怎么换的？ 是否有用枪头吹打的步骤？？

hcluo

我们在做 mouse embryonic stem cell 分化的时候，首先是hanging drops (500 cells in 20ul) for two days, then for 5 days in a bacterial dish, 然后将生成的EB细胞转至 0.1% of gelatin 进行生长. 生成的EB多少，关键看ES的细胞活力是否足够。这一点很重要。

igdb

回复 hcluo 的帖子$ v( i2 c4 X$ v' u4 P' k# m
6 I; Z7 Q1 z5 n2 h, G0 _
hanging法做的EB大小均一，研究分化非常好。可是接下来要提RNA做RT的话，是不是细胞数目就很难保证够用了？？那请问HCLUO，你们做分化接下来怎么验证分化情况呢？？

hcluo

这个确实很难做到统一啊，要是细胞能做到统一分化就好了，所以有时候不知道细胞分化成什么类型了。另外，就是参考文献，根据以前别人的经验，到了一定的时候就可以进行RT检测，或者最好做个免疫荧光检测，看是否是你想要的细胞类型。

hcluo

这个确实很难保证啊，尤其是在体外分化到一定阶段的时候，可能由于某些因素，导致EB细胞分化差异，出现细胞形态不一致的情况。不过这个只是初步的检测，一般要进一步分化，必须查阅一些经典有用的文献，最好选择好一点的杂志，参考他们分化的时间，因而自己也相应的按照这个方法和时间去分化，当然会有略微的调整，最后就是验证了，一般选用特异的RT，最好是特异标志物的免疫荧光检测。

igdb

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& r' G* d% J% G+ }
4 d- V+ l7 D& t! K  I      做RT需要一定量细胞数目的保证啊，你按一个EB500个细胞算，所需要的EB数目是天文数字啊。。这就意味着你得点上天文数字个hanging drop。。
9 q* k5 y( ]$ S# ] 当然我没做过这种倒吊的方法，你用hanging法做分化，后续试验里做过RT或者WB吗？6 V, t' r8 \/ y1 h" B

hcluo

现在有很多技术可以达到的，单细胞的RT都已经可以实现了，何况500个细胞呢，这个应该不是问题的。我们不做WB的，只是做免疫荧光吧，另外可能会做RT的。

igdb

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$ r( c# p% P, H) O- ], w
# I! l2 Y. G- S" A- g我觉得hanging法的工作量还是太大了，就是做个流式，需要的工作量也不小啊。 实验室较为常用的RT至少需要10万个细胞吧

hcluo

你做EB是为了定向分化吗，还是只是为了得到EB细胞就行啊？做流式细胞也行，不过也得要达到分化的细胞类型才行吧，而且还需要标记物吧。

zlx0814

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我们就是用细菌培养皿培养及MEF培养基悬浮培养（10%FBS ），效果很好啊
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