pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

runsong

+ s! g, h0 x4 w1 A

  F& i. l0 Q+ c本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。
; m  H% i7 p, `* u4 E$ h9 o( W但有几个问题想求教各位前辈" Z2 s3 L" h9 ^5 G, u
1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。; a/ E" @! ~4 U0 r
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。
- K9 f" ?8 b" q: C  B0 J8 j7 c0 `5 w

runsong

本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。0 @/ l' {3 P$ t3 J& \4 r
但有几个问题想求教各位前辈
( j* O' C; E. W+ h1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。
0 w8 B# c4 D9 f. S2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。" i6 O7 G+ l7 y, n1 r- b

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跪谢大神指点

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$ f5 N4 M# H& A- W, i* p2 G1 t) B# }3 ?# B2 g( B' U1 t
非常感谢您的指导，但我还有三个问题想再向您请教、确认：
% K- F4 x. v  y* ~1、若不在pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA也是会正常表达的，但GFP后会融合一个由pri-miRNA编码的小蛋白，有可能产生不可预知的结果，干扰试验。
+ S5 u1 {3 t2 f2、GFP是由未被卷入pre-RNA加工过程的mRNA翻译而来的。其数量要少于pEGFP-C1空载体的GFP表达量。
& ?, j. B7 n+ r: Y3、pri-miRNA克隆的长度有何硬性规定，前后各延伸100可以吗？! o/ g# |: v' S2 f+ s
4、能否给我几篇您已发表的文章供在下学习借鉴。
  u7 a- L. Y% l$ }( q6 ^; p: l最后祝您好人好运好心情！

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回复 深海寂寞鱼 的帖子+ ]+ n& X. C  p9 V% S) M
* b5 |. ~6 j6 d
我画的这幅图有错误吗% {7 w! Q* }7 C4 [$ G; \$ z

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回复 深海寂寞鱼 的帖子3 S" n( X& l, c2 z

# a! v8 c* K1 j7 X- Y: O. p载体图是用clone maneger画的  其他一切操作用的都是PPT或PS  
( e. ?' {* Q5 _$ Y7 Y! T我是土八路，信手涂鸦

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回复 深海寂寞鱼 的帖子7 V. Y: S1 Q$ n, S- T' B, D

7 y% Z  y2 s& S" K' Z2 W谢谢你从前的指点，一个多月前我按照你的方法把载体建好了，定量PCR显示34c上调了9倍（以5s为内参，34c与5s的Delta Ct由9.9上调为6.7），现在正在进一步探求34c诱导的效应。
$ E" C, |0 @  W3 g( g- o  y! E不知你们照此法得到的结果如何。3 p9 Z1 C; S' M3 H% n! A4 Z3 w

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& q8 w0 _* Y( D: C+ Q+ |/ P2 R7 d0 H+ s7 A8 A
我做的是瞬转，转染效率约为60%，转染后3天收样。你们那里还有做稳转的吗。

runsong

回复 sannia 的帖子; B$ J/ X3 X3 w9 i1 K

. {4 @8 q6 K; j, Z4 V我是按照深海寂寞鱼的方法做的，附件里有全部资料，不清楚的话再联系我。

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