pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

深海寂寞鱼

to runsong战友：6 l8 F; e  Z. d0 F
3 L+ O" a6 Y6 g' \/ `' V
   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。/ \4 j' o6 ^" v# j9 w# z6 Y

' @0 ~5 K# E4 j6 N, \& G   有两点需要注意：, L3 W. V( F* c: {9 c( a
7 C( [3 x. A# H3 a9 |" K
   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。. i9 M* l+ L: [: X  \) M& Q: n$ T
   
' b% R  ]* m1 ?( t4 T       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。: C/ K; K, [! v7 p

) N) \* _% r. L, Z       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。
) {, O' @4 g, w" A* ^8 Q
$ u; {- H- i$ t! G: V1 f       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。0 @' c; z% U3 I/ u/ s( p

/ Z" ^; K9 o2 s       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。" k$ o# ]0 z4 Y
* P5 p( |0 z" c( Z  I
    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。' n7 C; x+ ^6 f
4 \, K0 |  i# k9 ]4 u2 W6 E
大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

深海寂寞鱼

" n: z" }/ T6 v* ]3 @8 t) J- R' `# j/ `: Z
回复 runsong 的帖子
# s: x4 W1 G  v( q  [5 j- L* k6 K" \0 p# p
to runsong兄：+ C0 r6 f# o7 g0 J. r# T0 `6 \& E
- o( n. D! ~3 M, Z" ~5 ^9 a
    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。
$ ?+ Y0 V5 A' h9 M  t# q9 T
# R  ^0 @4 v, J3 L$ T1 C+ X    对你的问题回答如下：
) A+ \% r. @8 j
" h2 A7 W  k: M& L    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。
. f4 i1 N0 T5 P1 Z  J
. e8 ~, u) U* a# N) G5 W         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。; C3 X4 |0 Z/ ~
+ D2 ]0 ]5 h  A- h
       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。, U, Y: d: r" q& Q1 k

5 v" k1 Z" [) Y/ k        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。
$ u+ `1 M* W$ w9 p
; |7 f5 {1 k- U      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。- T6 G3 w* u; J0 u( Q' C
5 p$ X7 n, D9 h1 k: f( h
          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。
) B' `$ w3 x  {6 Y6 G. t& g   
3 _0 a, y3 V  \. K  {          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.
4 p; }* S2 d# G3 Q+ N    & @9 G5 D, `9 m
       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。+ B& e; H0 c5 X- b# |4 u$ e
        
( E5 n7 o& X5 D8 O& m3 r            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。
7 ?4 |2 F& Q+ h$ h( h% k! `" O+ R; ~! [
: W, L) R, p# x7 V/ {& K            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  1 s& r/ `& J3 c$ o6 X( p
% e) Z9 t, R& q0 a* }( \

1 I) Y2 f- ]7 d* \1 Z7 F         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。
' ~1 i. ^/ O5 m& ^5 v- t# ^1 A  
  G8 q9 Z' O: ?& ^  [! g             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。3 B- \  F+ q2 l- T+ Z

* r9 B6 r* s3 ~% I, r6 _
$ O1 N8 @0 m4 k5 h; q; F            最后，也祝你实验顺利，天天开心。5 b3 p9 B9 i% N! g( ], R0 r3 P

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子4 w  |$ I* k- z% |  f

% E: }* ?' u' S5 G4 x$ Y呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。
. P) E2 s# a8 V3 h* }
$ U! K- o0 G' x1 X! f  \我也很喜欢画图来说明问题1 C% L* e2 U1 N5 U
) J0 O  k+ `5 w1 E. n  R
不过跟你一比，我差的就太远了。: e$ A1 }3 {  }( Z: X' w# [! ~7 o

* r* F) I9 j5 X* U你的图怎么画，教教我啊。
4 K- S$ V% _% x( M4 ]) m( _1 z% B1 ]: Y; {
貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子7 S7 F4 E4 j2 y0 O; l
, p& p, g( E, B
恭喜你啊。
3 Y, ?6 l  X+ b8 j不知道你是做的顺转还是稳转？
7 s# s9 i. t: C, J我们通常都是做的稳转。不同克隆间的表达水平略有差异。. R) L( g# }  \( s/ K+ P
一般都是几倍到十几倍。- }2 O; k! l9 ~* v! z6 {0 x4 _
所以好像和你的结果差不多。