pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

深海寂寞鱼

to runsong战友：
; I7 g) I! ^8 G1 u5 W$ M! P* T3 c  u
) o5 [3 U# P' X   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。, X6 B0 c- k( m" Y
# P: {9 Q0 u1 k& x0 Z" X/ n) W: U
   有两点需要注意：
( n* K- H+ \% ^' s/ e$ l- C
$ U9 y8 E) X: x" R: I3 t   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。
$ e# p$ ]" _, |* k! }   
3 d: o+ r$ }* T9 w7 {       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。2 \0 M0 H2 S. Q& e

+ V8 Q1 y- ~2 M& a  h; L/ i9 S9 w       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。
5 Z: g8 z- i; {+ r# w+ `
8 ^, C; \+ V) s& R' L; W" `% K, S       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。( v6 F4 K) _+ o; Y$ C

7 ]  ~1 [! u) w       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。
# E6 Z: s; O' A+ r% W: {5 R4 c& u( D% x2 p; E
    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。. k* g* W  W8 I% Z
+ A9 D  x/ p. G; |; E
大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

深海寂寞鱼

1 D1 M6 z4 T5 a) [# l5 G2 ^

: e( v  V, M1 [5 M% j回复 runsong 的帖子7 y: m6 R0 w* E; S2 u7 |7 [; P

, H4 R9 D+ [+ F8 B8 Dto runsong兄：! E& g: G" g/ i' |
$ A+ o# o0 P  p* h6 _+ }4 [7 K7 J
    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。
) m  L9 H% V' ]1 ^9 q: T  M. i* A: a7 B% C/ T8 j/ L- F- X6 N: \9 m
    对你的问题回答如下：
$ T3 _' ~: C  e0 {' y- Q
7 Q5 }0 n8 ~! R( q    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。
! }3 J/ c+ ^4 s, ~1 A( q0 U3 U5 ?& [
: v5 a  K, q& e- D         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。
3 p; W$ _& ?5 q& D8 W* `; Q# ~% W9 W/ i- M1 g# r; g3 w& j
       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。
* Z' |+ f. f. f$ X- J8 b3 s: k2 t$ c+ @% l- Q; l
        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。
6 G( ^! U# w& I1 U8 d2 P$ _0 Q/ m& Z/ b" G$ r& X$ D
      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。; z2 B9 F' ]0 F. J* W1 Q" w

& f3 e  S8 K6 L! e          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。
- D/ h/ n3 X- H9 i( g3 l    ! R' N) V1 Y0 S
          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.6 a9 n7 a: x4 V" U. i- E  c7 d! k
   
7 H; K* N& O& B/ y; P' Y       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。
% ~" @' J; c- E5 H        
" D" H& t6 @- r0 Q0 e, `            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。
+ y4 f5 G6 h9 ^: {, T: B) T
  B* l3 a# D: i5 k5 Q) ]+ e: o            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  : ~3 _& T" }  V0 _

6 z. N; e* L* V7 Y9 b
) E1 b7 @. G% F7 ]         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。
# N. z; e6 b' k  + l1 h9 D: B/ h+ M! s
             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。
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# A5 K  n/ j5 O7 @            最后，也祝你实验顺利，天天开心。
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深海寂寞鱼

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) I* U! T" H6 l0 I' `& i0 y( |. B9 \% y: Q9 Y& {9 m3 M
呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。
  \9 {& L7 c4 [$ j: j! Z/ s1 T6 p7 [( x/ \
我也很喜欢画图来说明问题2 @7 X7 B/ l- A

7 F$ W" C# a' o/ q3 m不过跟你一比，我差的就太远了。, \# W' `, G# e" o6 E' f

7 s$ N8 s" h$ T+ D5 G你的图怎么画，教教我啊。
% U( D7 C+ H1 z
9 \4 Z8 s7 V+ F5 \3 C  R* {貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

深海寂寞鱼

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. `7 H4 K$ M+ H( e4 r( U; n
; w4 |. d2 _" w0 l) \1 G恭喜你啊。
, B9 P7 B# A0 ~% c不知道你是做的顺转还是稳转？: m0 u% d9 o- t( M' M( V
我们通常都是做的稳转。不同克隆间的表达水平略有差异。) r% A* E- d! m9 `' J7 U; W# X9 Q) k
一般都是几倍到十几倍。
" k/ P* d9 o8 {- V所以好像和你的结果差不多。