pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

深海寂寞鱼

to runsong战友：3 O# s* x- c6 H: k

0 T7 ^3 }- X4 h. e7 }   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。
  W* a# G( q8 a+ r3 Q/ J3 s0 g/ Y9 v2 X
   有两点需要注意：& v: G( }4 E; F
- F5 L$ @( b$ H  o$ X8 |
   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。; U# U- b! `+ s1 }
   
3 n  Z% O, }9 ?7 M/ `7 {       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。
, Y8 ^( z  U2 ?8 z. l
! f$ ^2 V6 z2 _& W       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。7 e& A+ Q" W+ A

3 E. O& R2 X) r3 p" K6 M       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。
2 y; K4 @2 B" [# v
! w0 Y( S6 Y( K+ x- w, p       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。
3 n- n* _+ I2 }' ?
3 b. d" a; W6 s6 H' J    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。! h) ]. T4 A: c
  ~+ t1 b9 [; m/ l1 j7 Z9 ~
大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

深海寂寞鱼

4 `4 j* G) p% k3 @6 [+ ~
# Q! h5 A, S" h; A8 W* t回复 runsong 的帖子
( ~, P* ]$ Z1 v: a6 h( K1 i& W" m( r0 K  I/ @1 H$ t: M
to runsong兄：
2 B' S: \$ L5 m3 g
. _6 B) U6 W: |3 r    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。& P+ r0 l. t3 S) ~
. J: ?5 I; R& r+ a
    对你的问题回答如下：' M6 Y! n9 h- n1 @  T# m4 f0 I& O

/ S+ G2 M3 @% e+ [" o  o# t    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。5 C; Y. k, ~7 _  p8 n
, X! G! Z. F! C& \" ?6 W5 X
         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。
5 V( R" U2 ?9 t0 m% P' k6 {8 `' [1 q) W& p3 A( p
       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。2 i8 N3 T/ ~/ ^& k* A1 s+ U' r- _
: x3 f+ S% C* [5 s: q" c
        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。
. r1 b, y" D" r8 f
6 }  v+ d' o; M* H( a1 I2 j9 a' T      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。' n$ N% b: y: x  ~  s! y0 q$ C
1 ^/ E5 f, N7 Z9 H$ Q
          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。2 A7 a# O& N+ j: z: \
    4 c7 L) f4 n: `$ ]3 r, Q
          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.6 {) S" N) z* U  I6 u
    0 T' Q9 Y! T" S! r, X1 T2 X
       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。
/ e/ C) `# l/ l0 T* m        ! a( {; m' b& o2 `8 O
            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。
/ W+ O7 V& [" S3 w' U- }
: C* u( \  s0 K1 ~9 K            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  
; v0 f" L! x9 x, I/ r  k9 D- u) K; y: a. f" F1 d5 _/ Y
0 \/ U2 |* ?' t. e9 l4 k5 U  {( Z
         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。
- \- W. R. S4 o% V" w) U8 {$ i  
2 P9 E) K' m7 j; f% [             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。
9 i9 p0 j2 c3 z# F4 ~
+ B6 s, v* W# t. H; g+ _" u$ C2 s! g+ }# H8 P+ a# i
            最后，也祝你实验顺利，天天开心。
# c: b$ R0 ?4 X, a( W7 n

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子
6 [8 o4 V1 ?; C. ?2 G: L3 J! d, y0 x& p7 q
呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。
4 |5 x* {5 w2 c" U
3 p3 t  k: q& g. h- P) A我也很喜欢画图来说明问题
3 P1 r& y' m2 u+ I2 P
9 ~5 ~8 C2 o8 O) |不过跟你一比，我差的就太远了。
1 z0 L) [! c& }+ o( n. N1 u) B
( `* c9 ?6 l2 N& R. Q你的图怎么画，教教我啊。
5 |2 E* r' u* `  a8 x
5 L: g: a6 h1 K& S% g貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子" y1 I! v) B4 k0 H' h4 W

+ b! y5 L+ `3 ^0 ?# F; ]6 M恭喜你啊。
2 y; s8 L& l( h+ s; W不知道你是做的顺转还是稳转？9 U- c, h' X* h2 L6 Z
我们通常都是做的稳转。不同克隆间的表达水平略有差异。
9 B3 I. g& m1 z) D0 ]- H) F一般都是几倍到十几倍。
" Y2 n7 B9 @- H" b0 m5 X- C所以好像和你的结果差不多。