新手求助：人骨髓造血干细胞获取、培养、鉴定方法及判断增值、分化能力的量化指标

pei

大鼠MSCs的分离培养 断颈处死Wistar大鼠（6周龄），消毒皮肤后，于超净台上取其胫骨和股骨。剪去其两端骨骺，于10cm2培养皿内使用含10%胎牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，反复吹打使之形成单细胞悬液。加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，接种于培培养瓶中。37℃, 5%CO2 培养，贴壁3天后换液；此后, 每周换液3 次。至原代（P0）长满后，用0.25%胰酶消化，按1：2传代，第5代（P5）用于实验。
6 A. V  \1 O) k7 d4 R8 b6 ]# }2.大鼠MSCs的表型鉴定 用0.25%胰酶消化收集MSCs，用培养液调节细胞浓度至1×105/ml。将细胞悬液加入置有盖玻片的6孔板中，48h后玻片取出，制成细胞爬片。4%多聚甲醛固定, PBS洗3次；0.1% Triton 室温处理5min；分别滴加FITC免疫荧光标记的小鼠抗大鼠CD29，CD90，CD45和SH-2，避光孵育1h；PBS洗涤, SH-2标记的细胞爬片加大鼠抗小鼠FITC 标记2 抗室温避光孵育1 h，PBS 洗涤；滴加50%甘油缓冲液后封片，荧光显微镜下观察有无FITC标记细胞。
' v8 E: P% k3 P3 H7 O) w* h+ g/ a