请教大侠们关于基因敲除的问题

懵懂干细胞

就是使用同源重组进行基因敲除是置换替代型载体，转座子打靶是插入型的（后面也可以剪切掉但会有痕迹），锌指核酶是剪切型的，老是看到文献上说替代型的较插入型的和剪切型的好，那么好在那里呢？对目的基因所在的DNA的编码有影响吗？什么影响？还望大侠们赐教！

chochochocho

不是很明白，大概是这样理解的：插入型，是随即性插入整合，不能人为控制插入位点；而homologous recombination（同源重组？）就可以通过构建target两侧的homologous arm进行定位的交换，达到KO的目的呢？如果不是定位的，很难保证KO的彻底吧

懵懂干细胞

* V& c( l- J/ @5 p

. Z5 L( V, [! {& k, K  G回复 chochochocho 的帖子
' q9 D+ _& v& ?+ ?* |  }
. m0 R9 H# T$ ^6 O嗯！谢谢你的回答！保证KO彻底！！！这应该是个重点之一！！. Y, Q/ w, J0 E3 c# y4 u. r
这也涉及到效率问题，转座子随机性比较高！1 y: P% _1 W3 m$ |7 [+ ]2 ~, i* N" A
不过我想知道的是替代型、插入型、剪切型之间的差异和优势！' N* ~* U9 }3 f+ V5 g, G* C' g
另外想知道的是这三种打靶后的影响！！！

iseeyou1210

我觉得插入型和剪切型对genomic DNA的修改太大，而且可能造成一些其他调控元件的破坏。
1 l& O9 y7 f( M1 T替换型保证在保证ko的情况下，可以最小程度的改变DNA的序列。

懵懂干细胞

回复 iseeyou1210 的帖子
' {9 e" d3 {/ `- V- w7 W& d' I1 E1 j1 n5 d4 e
嗯！那是不是为了减少造成的影响需要将打靶载体中目的片段设计的和被敲除的基因片段一样长短呢？

chochochocho

如果要敲除一个cluster那至少是M单位的，不可能。但一般情况下设计HR+HF （arm only）同源序列5-6kb吧，短不易重组，长不好构建

懵懂干细胞

回复 chochochocho 的帖子! e: j3 y; g) C1 t5 t
6 Z; v$ D3 P, B, V
嗯 是的。M单位什么意思啊？？

chochochocho

Mega base pair

懵懂干细胞

回复 chochochocho 的帖子
2 j; N, R9 ~( @1 ^+ q8 F
: ^$ u* o4 d! V& J6 athanks!!!!

chochochocho

( U# r" v( K& u3 i, ~
2 \& \0 w% T3 B" F8 Q7 P5 G5 u回复 懵懂干细胞 的帖子
: H, ]" c$ @/ b# S2 {* Q
. Q: y( v& W  }2 D+ c0 ?1 F我想说的是：“定点定位”是关键！你理解错了