双酶切连接的一些问题

sidalin301

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不像是污染，大部分克隆都有300bp的杂带；fermentas的连接酶的说明书上说粘端连接时酶量为1u，线性片段环化则加5u，我怀疑是不是加的酶量多了导致载体质粒自身环化？

sidalin301

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+ C9 y" V, _0 j, @5 _. x: D6 x+ p
1 s8 `: i% p4 n9 k- U  X5 v$ n引物两端带有酶切位点；没有做Blast，因为带酶切位点的引物无法做；几乎大部分克隆都有300bp的杂带；双酶切时就见到2条带，300bp和10kb。

sidalin301

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) Y/ t& B7 [- e2 f# c
  ?0 [4 q* o0 p: l大概有18 个小时吧，时间久了为什么会长出卫星菌落？抗生素及其浓度没有问题，我做过对照，没有转化的细菌就没有长。

chochochocho

总结你的情况：载体10kb，从双酶切（去除300bp）后胶回收；插入片段900bp1 h  n7 L0 Y# o) A7 x) N: o! S* h
问题1有关300bp杂带，1，引物是设计在载体上，插入片段两侧吗？做了blast么？2，胶回收时电泳是什么条件？怀疑你的双酶切有问题，10kb与10.3kb在胶上也区分不出来。3，所有的克隆都有300bp条带？: ^$ V5 c0 H; W0 M: x1 ?- G/ p% K
问题2，赞同沙发。再有做好的抗性板儿1个月内用完最好，久了也不好解释问题。8 G/ [# d6 w2 G9 Y. v  {

张也行

PCR有阴性对照吗？是不是污染了之类的？
3 c8 |3 x! i  V, |1 k, m. a$ O在细菌培养基上培养时间太长就容易在周围长卫星菌落，所以要及时挑菌，中间有抗性的菌把周围的抗性抵消了吧。0 l( d4 M5 t7 c) u3 E0 Y
酶的量用多了应该没有关系吧，我那次也是，好像没甚关系啊，哈哈 只要体系加对就行了，再说你的菌不是也长出来了吗？

siyue13

问题是你好浪费呀，本来可以多用几次的

ghfvcat

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' Y+ b( m0 t8 x8 r- W1：PCR有杂带不用管，你拿质粒去测序，对了就可以了5 U, u3 @' m7 I8 N; C3 n# b
2：时间长了点是多长？24H？有几个可能的原因，一是抗生素有问题，或者是浓度或者是质量，所以导致没有抗性的克隆也可以慢慢长大，或者感受态有污染之类的，二是长的时间太长了，长出来的卫星菌落？
4 j# _  s& @) @/ M0 u! v连接酶加1UL肯定没有问题