请教一个连接反应的问题

chochochocho

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2 p1 P3 I; @/ c+ d& [' |( Y我被你的问题弄糊涂了，你说你连接体系10ul，其中目的片段8ul，载体1ul。余下的1ul是连接酶么？不用加Buffer的么？？你用的是哪一种ligation kit啊？

chochochocho

回复 mckf111 的帖子% M4 |! _' D7 W+ T. H9 d

9 ?3 t. z! r2 }你的目的片段用什么溶解的？如果是TE的话，换成MQ。DNA浓度不够的情况下，可以先做乙醇沉淀再连接，不要用大体积的DNA溶解液做链接体系，离子杂质很多，影响连接效果。frementas没用过。我通常取1ul（50-100ng）电泳，一般不会只有一条带，还会有一些小size的杂带，但目的片段与载体连接后的产物带最亮。想不通啊，你的DNA都哪儿去了呢？

chochochocho

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* v" X3 ^" r# m. Z& tMilli-Q water就是蒸馏水再0.22um过滤的那种，我不知道是叫灭菌水？还是去离子水？还是什么的。离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。哦，你胶回收之后做了电泳检测了么？估计大概浓度多少？7.8ul是多少ng？

chochochocho

哦，超纯水啊。如果你用离子溶液溶解的DNA，在做连接的时候你所加的DNA溶液要小于连接体系的1/3。
3 G* C2 C* |( c9 O( h比如：连接体系9ul，那么DNA<3ul； 要是用超纯水溶解的，就没关系了，但是由于缺乏离子环境不能长时间保存DNA。

chochochocho

你们都是猛人结果可以么？不会变少的，你没明白我的意思，DNA量没有变，是被浓缩了。比如：500ng质量不变，体积从7.8ul到2ul。我从没用过ddH2O做过分子实验，都是用的MQ，不过我想都一样吧。

chochochocho

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% |  Z: F+ L" |9 I* S4 ?回复 mckf111 的帖子5 i& {. V8 v5 y
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1，乙醇沉淀步骤：我刚发了新鞋，你看看吧，希望对你有帮助。/ M. n- K3 u/ K
http://www.stemcell8.cn/forum.ph ... mp;extra=#pid269345
$ J% c2 D) b+ \2，MQ和dDW不是问题，不用在意。
- J, _2 c  P2 w& V: ~$ P; ^3，连接后由于杂带多，亮度确实会弱很多，看你的电泳结果还好啊，说明连接没问题。最上边由于没有marker,估计不出大小，但3,4泳道大小有差别，貌似连接了。建议转化，扩增，检测。杂片段在转化后自有抗性筛选
/ ]# G$ l1 e  i9 ~7 Z) j' A4，你个人认为这和你之前电泳结果相似么？想看看你发帖子那次电泳图。
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chochochocho

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8 r& w5 z0 I6 H0 l回复 scl6682005 的帖子5 z) q. E1 i& X- ]7 d1 N% g0 K
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个人认为跑胶查看是很有效的方法，可省时省力省money，值得尝试，目前111所要积累的就是经验，如何判断连接结果。我想你没有检测过，其实结果并不只有3种片段。虽然1ul上样，可能是100ng，500ng，1ug 做实验‘老老实实’，那是technician；做科研，不能太‘老实’，有想法就可以尝试啊。, h3 b' W+ v/ w, C) A9 N' Z