人脐带间充质干细胞（原代培养）,天天更新；望前辈指点，新手相互讨论 共同学习！

wenfeng8212

小子我2.21号从妇产科找人要了一段脐带，放入装PBS瓶中，拿回实验室后，用PBS清洗、去除血液，按照会员ID  “wuxiao101325 ”的方法----脐带MSCs培养操作规程;上几张图：
4 H' i/ |5 C7 U0 ]7 |7 o2 N5 Y( c* N' G# \2 a
我去除了血管，加入0.1胶原酶II 4ml, 37度培养箱消12个小时左右，肉眼基本上看不到组织块（有几管还是没有完全消化完,也接种到培养瓶了），未离心，然后用5ml 长枪头吸入到25平方cm的塑料瓶中，再加入DMED/F12完全培养基5ml (DMED/F12+10%FBS),37℃、5%CO2孵箱培养.明天就是第三天了，不知道能成功不；我想问一下，半换液怎么换（直接吸出一半后再加入等量的培养基吗）？，三天后再次换液是全量换完还是继续半量换液？望培养过的XDJM 指导一下，小弟万分感谢！也希望新手来共同讨论...
! P& x& V- H* ?% y

tangyvhuang

半量换液就是吸取一半的培养基弃去，之后补加进去新鲜的培养基，如，你现在的体积是10ml那么，你吸弃5ml培养基，之后加入5ml新鲜的培养基，就是了。后面的换液就是全量换液了，
& i) R5 D4 h. j. B) ~不过我个人估计你这个细胞不会太好吧。因为我一直不是很认同这个方法的，细胞消化液太粘稠，不利于细胞贴壁，看情况吧，好运

皮搋子

看你弄的蛮干净的嘛，不需要半量换液，直接全部换就可以了

清影

回复 wenfeng8212 的帖子
6 j: A( Z0 c$ f4 N* d: G/ @7 Q2 v/ }7 s" A: d1 s5 d: o+ i; G8 o
帅哥，加4ml0.1胶原酶2，你分离的脐带是多长？消化完的细胞悬液直接接种在T25上，似乎不可行，胶原酶2的存在影响细胞贴壁。三天一般是长不出来的，更何况你接种的消化液。半量换液就如你楼下的仁兄所说的，但是是否第二次也要半量换液的具体看细胞贴壁情况来定！就你分离的情况来看，细胞即便长起来了，也应该很杂，因为你没有去除表皮

wenfeng8212

回复 皮搋子 的帖子$ @& f7 m% I: V& b7 v

$ v) f9 Q4 E  W4 B4 r: Y0 K谢谢楼上的。但有论坛会员说第三天左右半量换液，第六天是全量换液。大家给个建义啊，第一次换液是半量还是全量换好？等会儿就要进实验室了。

fengxuechunyang

个人建议：出细胞就全量换，没有就半量换，期待你的结果。

清影

: G6 O) }0 M/ t/ V. }8 ^

. B: T4 [, g" x5 ~' T" I2 p( ^8 T回复 wenfeng8212 的帖子
0 z; ?1 W, |! p  I8 m% u- K  |4 [# p  _
第一次换液得根据细胞贴壁情况决定，只有少量贴壁就只能半量甚至1/3量换，贴的好就可以全量换了

呼吸

细胞长的不是很好的时候先全量换液，过几天在半量换液，如果半量换液长的还不是很好的话，可以适当增加一次半量换液，4 C6 p2 b; @# A' K; u) z* `' r
不建议用酶消化法，建议采用剥华通氏胶的方法，细胞很容易贴壁，长的夜很好# j6 X9 [" m5 I! c

askage

# }' a/ A# I2 u+ m2 J
7 l& ~2 H2 x9 S3 s
回复 wenfeng8212 的帖子
5 C% j( v. w% u) P
, H) S+ y" ~7 {  h5 I消化的时候，放在摇床里，消化更彻底。
5 k0 t( s) o0 c; L% S正如楼上所说的那样，始终有部分细胞贴不了壁，即使你小体积稀释后离心，离心后上清中还是有纤维状细胞。但我认为大部分细胞都应该贴上去了（在有胶原酶2存在下，能贴壁的，我认为个个都健康，是科比。贴不上的，是残废）。大比例稀释，我没做过。首次换液时间我认为应该再提前点（你这种方法），因为胶原酶2一直在起作用，虽然接培养基后，胶原酶2浓度稀了。

wenfeng8212

感谢这么多好心的朋友，下午或晚上再来向大家汇报今天的情况，谢谢你们！