紧急求助诱导IPS的逆转录病毒包装方法

ada800515

本人刚开始做ips方面的实验，最近一直在做逆转录病毒的包装，但转染效率很低，每次只有几十个绿色荧光。质粒是pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有一个VSVG的质粒，按5：3：2和10：9：1的比例（共2ug）用fugene HD转染293T细胞（6孔板），48h后看到荧光很少。想请教有经验的前辈给指点一下，看哪个地方有问题。

jefferson

ada800515 发表于 2011-3-4 22:03 ( R) G' @5 z5 ^  h- q* {
本人刚开始做ips方面的实验，最近一直在做逆转录病毒的包装，但转染效率很低，每次只有几十个绿色荧光。质粒 ...

9 M& _6 I- E# Q8 H2 T: u1. 为什么你要同时共转PCL和VSVG的质粒. PCL质粒本身就包括了gag/pol/env三个基因, 也就是说足够包装出Retrovirus了, VSVG我不知道你用的什么质粒,这个一般是用来编码慢病毒的壳蛋白的. 这两个不必一起转. 根据你的实验, 应该只要转pMX和PCL质粒就可以了.$ g  y4 ^9 V( O3 q. Q0 M
- H) p$ }/ h" |& ?% Z2 ~
2. 两种质粒的比例, 可以提高PCL的量, 以1:1的比例转. 每种质粒2ug, 共4ug.! w8 x4 z. `3 F5 h: c
7 w1 W- b- H6 ~  ?. s" Y2 E0 o  x
3. 转染试剂. 这个是最重要的. Fugene HD我之前没用过, 但是根据我们的实验, 转染293T细胞, lipo2000要比Fugene 6转染效率高很多. 所以建议你换用Lipo2000转.6 B1 R. h( O% F) R
) L+ ]1 V5 Z# F  y9 P6 o$ t
4. 如果你刚开始包装病毒, 最好用100mm dish包, 六孔板的量有点小, 如果效率不高的话, 产的毒基本没用.

inankai

基本同意楼上的观点，VSVG 外壳蛋白可以增加病毒宿主的广泛性，用VSVG包装的病毒，可以用来感染human, mouse, rat的细胞。而Eco只能感染mouse，rat。所以除非楼主做人类细胞的iPS 才需要共转染VSVG。
3 Y# Y" z1 }/ k楼主首先要解决的是转染效率，然后再去提高包装效率。1 l6 L' [& z) k
例如，不妨只转染pMX-IRES-GFP-hNANOG载体看看荧光的量，应该会非常非常的亮的绿油油的一片才对。
: G" s8 Z0 O. _+ t当然，摸条件期间，还是推荐6空白，甚至12孔板，毕竟你是在优化转染条件，节省转染试剂还是很必要的（富豪级lab除外）。4 g* K6 U( N) a& R) @' e! d
直到能把GFP转好，再谈包装。
" V2 F7 K. a) H  r. _
+ m$ H; N: X$ Q- m9 }9 X

ada800515

谢谢楼上的回答，我确实是要做人类的ips, 那是不是需要共转染VSVG啊？

inankai

你可以可共转染VSVG或者用pCL-Ampho代替pCL-Eco。 用Ampho包装的病毒同样可以感染human和mouse的细胞。
8 b7 W6 v2 O: A% Y6 R5 A- O6 q具体的你可以看原始的文献（附件中）。, x& `8 R1 E# c: {
我觉得你当前的主要问题还是先把转染效率搞定先。/ l- o% ?( z# F
  m7 [& @. s& e" I  C: B

ada800515

楼上的说用lipo2000转染效率高，我看资料上的方法逆转录病毒一般用fugene转染啊

inankai

相信党的领导。7 @* t/ F; a5 E/ [' {, ]9 s* M/ i
Lp2000转染效率确实比fugene高，而且LP2000相当稳定，重复性高。
. |- i7 o/ ]: F9 ?# N0 l9 zFugene的优势在于细胞毒性小，在低密度转染的时候，有一定的好处。但是仅仅限于fugene 6。
/ Z) A: l2 B" v. W3 H9 @Fugene HD的细胞毒性也不小。. K$ t$ z2 R8 u
我试过做低密度转染，不换液。转染后第二天用LP2000转染的细胞状态非常差，而fugene 6转染的则基本正常。
0 z1 a. r3 ^) t' U: ~而在高密度的情况下，LP2000的细胞毒性甚为轻微，可以忽略。
: H9 X+ I) N6 ?( Q1 Z: D  M" T& S$ ?+ N+ z" k+ E1 ~
另外一个推荐LP2000的原因是它的可转染容量比较大。6孔板的每个孔用量可以达到4微克，而Fugene则只有一半左右。
6 |! U7 H" S8 n( K8 m% M( ?9 `
2 l  n* [, g, V4 P& I纯属个人经验。

ada800515

马上就用lipo2000做一下试试，希望能有好的结果，很感谢。

ada800515

刚看完用lipo2000的转染效果，24h后一点荧光也没有，不知道到底是什么原因。急切希望明白人能给点建议

gact

为什么只用一个因子nanog啊？？？
8 s) H+ v- A4 }3 h% b  w0 Y这个载体可以寄给我吗？--------------------pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有一个VSVG的质粒