紧急求助诱导IPS的逆转录病毒包装方法

ada800515

本人刚开始做ips方面的实验，最近一直在做逆转录病毒的包装，但转染效率很低，每次只有几十个绿色荧光。质粒是pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有一个VSVG的质粒，按5：3：2和10：9：1的比例（共2ug）用fugene HD转染293T细胞（6孔板），48h后看到荧光很少。想请教有经验的前辈给指点一下，看哪个地方有问题。

jefferson

ada800515 发表于 2011-3-4 22:03
2 [2 Z3 w- a; m& I" Q$ V本人刚开始做ips方面的实验，最近一直在做逆转录病毒的包装，但转染效率很低，每次只有几十个绿色荧光。质粒 ...

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1. 为什么你要同时共转PCL和VSVG的质粒. PCL质粒本身就包括了gag/pol/env三个基因, 也就是说足够包装出Retrovirus了, VSVG我不知道你用的什么质粒,这个一般是用来编码慢病毒的壳蛋白的. 这两个不必一起转. 根据你的实验, 应该只要转pMX和PCL质粒就可以了.
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2. 两种质粒的比例, 可以提高PCL的量, 以1:1的比例转. 每种质粒2ug, 共4ug.
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3. 转染试剂. 这个是最重要的. Fugene HD我之前没用过, 但是根据我们的实验, 转染293T细胞, lipo2000要比Fugene 6转染效率高很多. 所以建议你换用Lipo2000转.
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. {4 Q* n. w) Z& M4. 如果你刚开始包装病毒, 最好用100mm dish包, 六孔板的量有点小, 如果效率不高的话, 产的毒基本没用.

inankai

基本同意楼上的观点，VSVG 外壳蛋白可以增加病毒宿主的广泛性，用VSVG包装的病毒，可以用来感染human, mouse, rat的细胞。而Eco只能感染mouse，rat。所以除非楼主做人类细胞的iPS 才需要共转染VSVG。
; y. ?9 Y, v, d6 J8 N2 T% h楼主首先要解决的是转染效率，然后再去提高包装效率。( ]% R, k$ Q7 f) O: V: N' V8 T
例如，不妨只转染pMX-IRES-GFP-hNANOG载体看看荧光的量，应该会非常非常的亮的绿油油的一片才对。* a$ @: w8 m+ K1 C; g
当然，摸条件期间，还是推荐6空白，甚至12孔板，毕竟你是在优化转染条件，节省转染试剂还是很必要的（富豪级lab除外）。4 n. M- a' W& t, ]/ n1 T* D# v
直到能把GFP转好，再谈包装。* K" ]" |5 p) y3 U8 P2 _! v
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ada800515

谢谢楼上的回答，我确实是要做人类的ips, 那是不是需要共转染VSVG啊？

inankai

你可以可共转染VSVG或者用pCL-Ampho代替pCL-Eco。 用Ampho包装的病毒同样可以感染human和mouse的细胞。$ A5 N7 l3 ~1 X- r4 R. K2 O% r
具体的你可以看原始的文献（附件中）。
9 O& ^4 b( O! N  T6 f/ {3 M% J我觉得你当前的主要问题还是先把转染效率搞定先。
; J2 l" M6 l% X$ k. }' N' s
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ada800515

楼上的说用lipo2000转染效率高，我看资料上的方法逆转录病毒一般用fugene转染啊

inankai

相信党的领导。% I" u& u* s# K* h: D& S# \3 Z
Lp2000转染效率确实比fugene高，而且LP2000相当稳定，重复性高。
/ ^* s& i  W  m% mFugene的优势在于细胞毒性小，在低密度转染的时候，有一定的好处。但是仅仅限于fugene 6。 ; W. I/ E4 M2 U+ k) F
Fugene HD的细胞毒性也不小。
3 `5 t- i3 g- z我试过做低密度转染，不换液。转染后第二天用LP2000转染的细胞状态非常差，而fugene 6转染的则基本正常。
$ Y% c- v/ G. Z, X而在高密度的情况下，LP2000的细胞毒性甚为轻微，可以忽略。4 Z- J; J, f+ Z/ a$ n
1 i+ g- w  J8 r1 @& V
另外一个推荐LP2000的原因是它的可转染容量比较大。6孔板的每个孔用量可以达到4微克，而Fugene则只有一半左右。
1 I1 O+ @$ j5 d( {9 Y5 \. v# }# V1 l. C7 Y5 `1 M
纯属个人经验。

ada800515

马上就用lipo2000做一下试试，希望能有好的结果，很感谢。

ada800515

刚看完用lipo2000的转染效果，24h后一点荧光也没有，不知道到底是什么原因。急切希望明白人能给点建议

gact

为什么只用一个因子nanog啊？？？
9 T" f+ u" K2 J9 U8 N7 H这个载体可以寄给我吗？--------------------pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有一个VSVG的质粒