紧急求助诱导IPS的逆转录病毒包装方法

ada800515

本人刚开始做ips方面的实验，最近一直在做逆转录病毒的包装，但转染效率很低，每次只有几十个绿色荧光。质粒是pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有一个VSVG的质粒，按5：3：2和10：9：1的比例（共2ug）用fugene HD转染293T细胞（6孔板），48h后看到荧光很少。想请教有经验的前辈给指点一下，看哪个地方有问题。

jefferson

ada800515 发表于 2011-3-4 22:03 & ^* ]" _6 G) s6 u1 t" G" y' F
本人刚开始做ips方面的实验，最近一直在做逆转录病毒的包装，但转染效率很低，每次只有几十个绿色荧光。质粒 ...

1 q, N  k; _# W( q7 ~0 l/ I1. 为什么你要同时共转PCL和VSVG的质粒. PCL质粒本身就包括了gag/pol/env三个基因, 也就是说足够包装出Retrovirus了, VSVG我不知道你用的什么质粒,这个一般是用来编码慢病毒的壳蛋白的. 这两个不必一起转. 根据你的实验, 应该只要转pMX和PCL质粒就可以了.
% N3 S) ?. A; d
3 q* u7 A0 O2 U8 G, D$ V2. 两种质粒的比例, 可以提高PCL的量, 以1:1的比例转. 每种质粒2ug, 共4ug.$ A9 z; P4 q! M7 _
6 ?: I# ?! G6 M" a' I8 E; Q
3. 转染试剂. 这个是最重要的. Fugene HD我之前没用过, 但是根据我们的实验, 转染293T细胞, lipo2000要比Fugene 6转染效率高很多. 所以建议你换用Lipo2000转.  F* @5 [; [0 ?5 C; J3 p0 ^+ ]
0 k# h2 K9 i! x+ g1 N% f4 M
4. 如果你刚开始包装病毒, 最好用100mm dish包, 六孔板的量有点小, 如果效率不高的话, 产的毒基本没用.

inankai

基本同意楼上的观点，VSVG 外壳蛋白可以增加病毒宿主的广泛性，用VSVG包装的病毒，可以用来感染human, mouse, rat的细胞。而Eco只能感染mouse，rat。所以除非楼主做人类细胞的iPS 才需要共转染VSVG。
5 l: H; B1 Q$ s4 ]  g, ?5 ?, R' _8 n: Z楼主首先要解决的是转染效率，然后再去提高包装效率。0 K+ z/ G$ @/ Z/ @9 ~3 R5 z  L6 B
例如，不妨只转染pMX-IRES-GFP-hNANOG载体看看荧光的量，应该会非常非常的亮的绿油油的一片才对。% J6 {& J" H4 Y: g: G( H! Y& w/ c
当然，摸条件期间，还是推荐6空白，甚至12孔板，毕竟你是在优化转染条件，节省转染试剂还是很必要的（富豪级lab除外）。+ l" A" {- Y" z  Y, r3 s/ c7 H7 X8 s
直到能把GFP转好，再谈包装。
" ]  {( W+ j/ N. J0 ~
* b* n3 [$ ?$ l6 F$ c; ?. r: T  k

ada800515

谢谢楼上的回答，我确实是要做人类的ips, 那是不是需要共转染VSVG啊？

inankai

你可以可共转染VSVG或者用pCL-Ampho代替pCL-Eco。 用Ampho包装的病毒同样可以感染human和mouse的细胞。1 {& }8 p6 d0 ~! d; ]& R
具体的你可以看原始的文献（附件中）。
  }% U; w- e$ |4 Y我觉得你当前的主要问题还是先把转染效率搞定先。
6 f1 {2 W( j3 l) ]4 C2 a+ n
# @8 l0 b$ u# c" I' ?

ada800515

楼上的说用lipo2000转染效率高，我看资料上的方法逆转录病毒一般用fugene转染啊

inankai

相信党的领导。
% T6 `5 z) e4 U/ \0 h7 {& E. M* {% eLp2000转染效率确实比fugene高，而且LP2000相当稳定，重复性高。& m' x9 e% d8 S8 W1 `: {
Fugene的优势在于细胞毒性小，在低密度转染的时候，有一定的好处。但是仅仅限于fugene 6。 5 g1 [' D9 S. L! Y6 d& v0 p
Fugene HD的细胞毒性也不小。
9 j7 ?2 x: t9 [& I我试过做低密度转染，不换液。转染后第二天用LP2000转染的细胞状态非常差，而fugene 6转染的则基本正常。
. |, T4 }# `9 V6 @* U0 g而在高密度的情况下，LP2000的细胞毒性甚为轻微，可以忽略。8 t- V. l4 q: c% U4 i( p3 b" f0 W7 O
" V5 r% f0 h4 x! p
另外一个推荐LP2000的原因是它的可转染容量比较大。6孔板的每个孔用量可以达到4微克，而Fugene则只有一半左右。9 V, ^: b4 l  d7 t2 ~& ~. }
' h# a5 M* ]/ k! s9 ?3 X
纯属个人经验。

ada800515

马上就用lipo2000做一下试试，希望能有好的结果，很感谢。

ada800515

刚看完用lipo2000的转染效果，24h后一点荧光也没有，不知道到底是什么原因。急切希望明白人能给点建议

gact

为什么只用一个因子nanog啊？？？2 e1 q1 i% h! b$ v& E( J
这个载体可以寄给我吗？--------------------pMX-IRES-GFP-hNANOG,PCL-ECO,还有一个VSVG的质粒