求教：如何提高脂质体lipofectamine TM 2000的转染效率

qingbao

4 U' l1 G) U% p0 X& ]1 H; s" U
# n9 X7 |! K' ?, L3 p! x* e我看转染效率的问题大家已经在这个帖子里讨论了很多：http://www.stemcell8.cn/thread-35512-1-1.html。0 q3 u% e" q) u
用阳性表达5-10%的细胞来作稳定压力筛选还是有些挑战的。建议还是要把转染的阳性表达率提高上去再做后续筛选比较合适。另外做稳定筛选的G418给药压力是要事先做梯度的。给你一个我自己总结的protocol，看是否对你有帮助。
* r' }9 M+ H( E* A 文档 2.pdf (27.45 KB)

2011-3-8 13:43 上传

请用IE浏览器下载
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

2 W4 ]; F2 t8 X5 a# l
本来想粘贴word的，但是表格会乱套。所以只能用附件，没有设下载包包的，不知最后是否需要你的包包。
3 z/ J* p, Y* c$ d又试了一下，给你贴图了，这样可以不需要下载就能看。% a, p3 T2 D' `/ [4 {- g

2011-3-8 13:48 上传

下载附件 (99.68 KB)

qingbao

回复 mckf111 的帖子
  i; |# s* M* }  ]3 ~6 K3 d2 J, T' C1 K. S
1）在根据转染试剂说明书要求的融合度时转染，一般70%左右即可。）但是因为细胞生长速度不同，所以还要确定细胞转染48小时后或是新霉素筛选前才长满。因为生长接触抑制会降低目的基因的表达。3）确定细胞在转染后48小时以及药物筛选过程中生长状态良好。如果在瞬时表达阶段细胞不健康，可能是提示有潜在的毒性。1 i. I) J7 Q! V. Y0 e; T
顺便再说几点要注意的：
1 E& r, z# j; l: |4 X  f1） 得到的稳定转染细胞的荧光表达量会低于瞬时转染的细胞。因为瞬时转染时，质粒进入细胞后以游离的形式存在。目的基因的表达是通过细胞的转录与翻译机制进行的。一个细胞可能‘吞入’数个质粒，因此细胞间会存在差异。总的来说，稳定转染的细胞只含有1-2个被整合的质粒。$ W. \9 `$ x2 R5 k
2）做G418杀伤曲线。如果筛选用的药物太浓（不同批号间的药物浓度可能不同），选择压力过强。报告基因的表达水平与筛选抗性基因的不完全正相关，细胞在过高浓度的药物中生长，报告基因的表达反而降低。过高的药物浓度也可能影响了细胞的生长状态，进而影响报告基因的表达。这些副作用在长时间的筛选过程中尤其明显。筛选后的细胞培养，建议药物浓度降低为筛选时的1/2到1/5。' e& ?; Q5 r3 y  y2 K) H/ `
3）总的来说，细胞培养时间在1-2个月内表达比较稳定，因此，建议分装冻存筛选过后的细胞，然后复苏原管，以确保细胞的统一性。
% G& u2 R( p$ ^% R, P

qingbao

稳定筛选的原理：5 C4 Q# o5 ]7 o/ r! S
被转染的质粒DNA带有可供筛选的标记基因，如胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因或者新霉素磷酸转移酶基因等。当携带相应抗性基因的质粒在被转染的细胞内表达后，用相应的抗性药物即可将转染细胞筛选出来。在真核细胞中以新霉素抗性基因比较常见。/ ]  L6 Z, i! l3 d$ W
新霉素抗性基因来源于转座子Tn5，其编码的细菌磷酸转移酶可使筛选药物G418失活。G418属氨基甙类抗生素，作用于80S核糖体可抑制蛋白质的合成。因此，未转染的细胞可被G418杀死，转染细胞却能够存活。真核细胞对G418的敏感性存在广泛差异。G418的使用浓度从100～1000μg/ml不等。所以，在使用G418筛选细胞之前，应将待试细胞置于含不同浓度G418的培养液中，以在3～6d杀死细胞的G418浓度为最佳。一般来说，细胞分裂越快，越容易被G418杀死。2 o: p/ Z+ v$ Y% u3 Q