为什么细胞没铺匀？

mbjane

我复苏的MEF细胞，将离心重悬的细胞悬液，加至10cm的培养皿的中间，十字方向摇晃了很多次，放入培养箱。
0 n$ e2 }  O4 o. H第二天镜下观察，细胞中间密集，其他区域较稀。且密集区域的贴壁细胞上吸附了较多死亡细胞。2 }3 j' g1 G) a4 t9 J/ ?, M. g
请教高手，怎么会出现这样的情况呢？对于培养皿，铺板均匀的关键是将悬液按需要体积吹打均匀后，s线滴加吗？9 F, ]( X; z2 T/ C6 w( f8 d6 K
7 F) t, m! z/ {- I( e. t

ndwzf

死细胞多是消化过度或离心转速过大。
. {" V; D9 I- `- Q) ?' E铺层均匀永远是相对的。
) w: @7 n% T1 G! M# O+ o3 [! O- y十字方向晃动时力量不要过大，放入培养箱之前在轻微晃动一下。

ruochenzu

其实只要用来铺板的细胞悬液中的细胞保证吹匀后迅速铺板
" O/ q+ X- i+ a1 b% I# y然后小心置于培养箱
$ o5 ~/ n( k% L' k# m: a( w5 o1 r一般不会出现铺不匀的情况

husanqiang

你可以在放入孵箱前在倒置显微镜下看下，均匀后在轻轻放入孵箱，尽量不要晃动。
% f0 s+ m5 B) `! _( O/ b6 W
) l& H5 [& a, o, x: k& J  o

张也行

回复 f5_105 的帖子
; t1 Q$ M$ n5 k* C) r5 [
5 S; Z6 L- z# B" s' K师姐真牛X，呵呵

f5_105

回复 f5_105 的帖子' q; p* I  L6 U% H! d0 l" p$ Q4 R
( g! R) j; m/ ~3 Z; [6 W
顺便多说一句，泡很多可以通过离心去掉，泡不多可以用新的注射器针头戳破

f5_105

回复 hyde 的帖子
; H4 i3 D% j# L  [; ]2 ~, n
$ a0 A9 G& J  \吹打均匀的时候，不要让移液管尖或者TIP头离开液面，拿枪的手应该随着液面的上升而上升，下降而下降，有点拗口，多练习几次就能不打出很多泡了。想当年我打出的泡把一孔板的液面都盖住了，体视镜下华丽丽地全是泡沫见不到细胞，练习几天后就不会了。

mbjane

感谢高手们的指点，我会继续尝试的，等成功了再来分享经验！

jefferson

hyde 发表于 2011-3-10 20:11
4 [! C! G9 i( Q& f0 u& v回复 jefferson 的帖子
: R9 ~3 n& ~6 q% s" X2 _1 ^" ?  X6 `2 n$ i
传代后很多细胞没能贴壁死亡了，是不是因为传代时吹打太猛或者消化过度^

5 Y/ a2 n: D* ~5 V0 X8 k
是MEF吗?* X/ X) v8 w% u1 ~4 p. j0 f. N
. ]2 O* t; }; p* E5 W# i' l/ S
MEF细胞还是比较好养的, 传代死细胞多一般不会是吹打造成的, 这个细胞没那么娇贵. 消化过度是可能的原因之一, 消化时最好摸索下胰酶的作用时间和用量, 一般最好要在两分钟内用最少的胰酶消化下来. 另外需要注意的是消化后用血清培基终止后, 最好离心弃上清, 然后再重悬接种.这样可以将消化时的胰酶去除干净, 避免对细胞生长造成影响.. U' |* {6 C; D4 ?! c+ F- _5 ?; p" i
$ `' I3 @8 v( r/ v1 s! n
另外就是需要检查下其他因素, 如培养基是否正常有效, PH值是否已有明显变化, 细胞是否存在污染, 如支原体污染等

希望之光

呵呵 我原来也出现过这样的问题 我的具体做法是：先在培养皿低加上一毫升得培养液将底部溶湿，再在中间加上重悬的细胞，顺时针转四圈逆时针转四圈，然后前后左右各四圈，力度呢得看你怎么把握了，我一开始时会在镜子下看 知道找到合适得力度，现在铺的很匀