求助：关于骨髓间充质干细胞冻存问题

stefan

     前一段时间养的狗骨髓间充质干细胞第3代细胞冻存于-80度冰箱2个月左右，现在复苏后完全死掉了，不知道是怎么回事，还请高手指点！" @) n) f1 I+ j3 G
    我冻存液是9:1的胎牛血清和DMSO，没有加培养基，不知道这种冻存液配制有没有问题？还有就是细胞冻存密度是不是小了， 我的冻存密度是1*105，但是复苏后，刚开始基本死一半，过后3天换液，基本上还未到一周后细胞已经死完了。在-80度冰箱冻存2个月应该没什么问题吧，还是必须要将细胞放入液氮灌中吗？现在细胞还未养成，下面的实验无法开展啊，比较急，还请各位指点，谢谢！！
& R2 f5 {2 F; D& V" h7 G

bulu123

我做的是小鼠bm 冻存液用dmem：fbs：dmso=5：4：1
, h# @4 ~# f/ a( r没哟问题

cjhpumc

－80冰箱放细胞最好不要超过一个月* U, w( f% s6 Q& p
冻存细胞的密度最少应该大于1X10^6$ k& G5 ?: c5 E
另外还要注意血清与DMSO混匀后要在冰上冷却后再冻细胞

jefferson

' x: d( O- C: U( ~- O9 |& M
0 O" Y$ m6 ~. r- G) Y8 r1 I- q0 S楼上的方法是对的$ V  m; C, w4 T( n: }0 G9 p- h) j! r
任何一种细胞都最好在-80度中放置不超过一个月, 有的肿瘤细胞在-80度放过一个月后复苏效率都很低了, 对MSC来说, 因其中可能含有一些干细胞组分, 因此最佳的冻存方式应该是用冻存液重悬后, 立即装入程序冻存盒置于-80度冻存, 24小时后即转入液氮.; ]% s$ d3 b( _6 y- }
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冻存液最好用培养时用的培基加10%的DMSO, 如果效果不好, 可以把FBS浓度提高到20%.
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! ^7 D% r7 u3 D; Y( N8 I  J冻存密度和预冷冻存液按照楼上说的方法.
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7 a- o8 j: k0 \另外复苏时最好先将解冻后的细胞悬液吸入15ml离心管内, 然后再逐滴加入培基并同时混匀, 让DMSO的浓度逐渐降低, 以减少对细胞的刺激, 进而提高复苏效率

金戈

! x1 r) J2 ?3 {( ?( @2 B
: X) |( Z6 O, v+ U2 e( B1 M
当然 细胞最好是放在液氮里冻存比较好。但是我不大同意说-80度不能超过1个月的说法。我在-80度曾经放上1年的MSC，复苏出来起码还有80%的活率。所有楼主说的冻存1个月时绝对没有问题的95%以上活率。. r9 f/ l5 o" s: \+ e* |' b% f
细胞冻存和复苏的过程的细节其实更决定了细胞的死活。& s7 m7 v  v+ T- \0 j
另外 DMSO在常温情况下对细胞是一种毒性作用，所以要尽快将DMSO与细胞分离，将复苏的细胞迅速加到新鲜的培养基中，洗涤离心一次，效果很好。————不少于3千次复苏细胞的经验，仅供参考。

stefan

谢谢各位的指点，现在正在做原代，希望细胞繁殖好后，冻存以后再用大家的方法试一试，总之谢谢大家！！

lunyuyuanxj

我们用的冻存液配方是培养基：FBS：DMSO=7：2：1，细胞密度约5*106，装入厚泡沫盒直接放入-80度，冻存后2个月复苏细胞存活率能达到约85%，还算比较理想。

hello2134

呵呵，跟着学习一下

willow0711

冻存液要有培养基的吧，我们实验冻存液要加培养基的，我和细胞研究的老师实验，冻存液的配置上多数是血清的比例不同，但是都是需要加培养基的