关于质粒转入细菌实验设计（诚心诚心相求）鸟枪法

heiguzi1988

请恕罗嗦的开头简述：+ {+ m* J; T9 y" f" z
我的实验是这样的。有一段DNA区域（大小约2.9Kb，位置已知，但区域内的序列不知。现在就是想测序出来里面的序列），这段区域二级结构很复杂，GC含量也比较高。曾尝试很多种方式扩增此段区域，但是均未成功（用了TAKARA的LA Taq高保真酶、用了高GC buffer、DMSO、甜菜碱等等）。
4 B. F0 t: y5 }; s/ g$ N" w4 {考虑到PCR扩增然后测序的手段几乎不可行，老师说尝试鸟枪法全基因组酶切打断，然后回收2.9-3K左右区域的电泳凝胶，连接上同样酶切处理过的载体，转入到细菌，培养出N多单菌落，通过菌落PCR检测阳性。但至今未找到阳性细菌克隆。
, L. H; }* {! }; Y+ `) Y$ J, l: ~& p故请教：
5 P# J3 Q& G" t+ ]" ?1，我用的是PUC19质粒，大小是2.686K，而我的片段大小有2.9K，T4连接酶连接。我个人觉得，PUC19质粒如果连接500-1K的大小DNA片段是效率可观的，但是2.9K的DNA片段似乎偏大。但是老师说，没有问题。请问，“诸位大虾觉得如何？有没有更好的载体可以装载这个2.9K片段呢？？（且同时能做蓝白斑筛选的更好）”" x3 N# E5 o1 f/ Y3 e( k
2，我用的是双酶切处理质粒、基因组DNA。但是双酶切的活性在buffer里只有60%，我最长用了30小时酶切。但是效果并不好。于是我尝试先用一种单酶切处理基因组DNA（这个单酶切位点在双酶切外围），然后电泳割胶回收单酶切区段；溶解后用双酶切处理上述产物，第二次电泳割胶回收。可，无奈的是：经过两次割胶回收的折腾，DNA损失极大。原先起初用量20Ug的DNA，最后只有2-3ng/ul，浓度太低。所以我想问下：“有没有回收电泳效率高的办法或者试剂盒？或者专用凝胶？”
! O! w8 T4 A; V5 f) \. B6 a3，这是全基因组酶切鸟枪法，平皿上的几百个菌落可能只有几个子时我真正要额阳性菌，碰运气的成分很大，但是我首先要确保在挑菌之前的步骤是无误。除了鸟枪法，不知诸位可否有更好的思路来解决这个区段问题？？这个区段是我们实验室此课题的一个大瓶颈，本身课题的分量也很重要。我也非常希望把这个实验做出来，持续了有将近半年，仍一无所获，故此诚心相问。不胜感激！！！！！！
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jun8013

那么大片段连T载体的确比较难，但是也能成功，只是感觉效率相对较低，不知道你是按照怎么比例做连接的，目的片段与载体几比几，看你的到产品很少，建议挺高目的片段的比例
0 J2 ]0 _8 S# X7 o1 `+ N7 [6 `. E你为什么不用快速酶呢，30h酶切。。。。。可以用fermentas的快速酶，不到1h就ok了，而且大部分酶的buffer都通用。如果感觉效率还不高，就分步酶切，没必要割胶回收的，直接用PCR产物纯化试剂盒就可以回收到你的片段，而且回收率很高，胶回收会损失很多的。

heiguzi1988

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“没必要割胶回收的，直接用PCR产物纯化试剂盒就可以回收到你的片段，”4 v3 g5 l4 R2 B: W; k! M! j# I
    请问下，我的片段是全基因组酶切后呈弥散型，不根据marker割割下那2.9K区域凝胶，仅用纯化试剂盒纯化是否可以？2 _" L5 G: R, c' n/ @% T
  

jun8013

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3 i4 u0 j$ p: ~9 \0 {
$ F; J0 h# \' T0 C+ v& u- P# K这个恐怕就不可以了。。。。。。。。。这个只能割胶了。。。

heiguzi1988

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- X/ T+ t1 P* a* r" B! j* M6 O; [- Y请问有没比较适合我这个2.9K片段大小的质粒呢？我觉得PUC19小了点。有大约4-5K的质粒么？我查了很久没有找到。另外，我用PUC19和目的DNA连接时的比例是“2.9K目的片段：载体PUC19=1.5:1”

jun8013

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. |% }% ?' p- t+ H: n  z我也帮你找找看有没有大的克隆载体，大的表达载体到是有，就是不知道他的拷贝数会怎么样，个人认为i你的比例有点低了，一般是3:1到7:1

heiguzi1988

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# I4 O# D; y+ i# J. ~8 h7 `那拜托了。有的话请回复啊。谢谢@！！@#！@#

amigel

用Takara自已的pMD-19T载体不就可以吗?我用这个T载体克隆过6kb的LA-taq扩增产物,据它们说最多可连9kb呢

amigel

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  Q1 _+ j3 P% N你的实验用T载体是最好的方法,我们以前测序过16000bp的线粒体未知序列,就是分成三个大约6kb的片段用Takara 的LA-taq酶扩,然后将扩增产物连Takara 的pMD19T载体,用的是配套的连接酶,然后挑克隆,选出的克隆送公司用步移法测序,最后再拼出全长序列.

王乾

我怎么感觉简单的实验被你搞的那么复杂