求助双酶切的问题

军医

我用双酶切speⅠEcoRⅠ 双酶切，但是这两个酶切位点紧挨着，切了一会儿没切开，有没有人提提建议啊，该怎么办呢？谢谢了

274996064

这两个酶切位点要是离得很近的话是不能用这两个酶切的    他们中间最少要有6-10个碱基   我建议你重新找酶切位点

lifescience1

你所指的切了一会是多长时间 10分钟 还是1小时  ？$ `, h% m3 R! f
我们一般酶切的时间按是1到3个小时之间哈  只要EcoRI 和SpeI两个的酶切位点没有重复哪怕只相隔一个碱基都能切开哈。

ljzmy82

酶用的是哪个公司的呢，NEB的还是Femertens,还是用好公司的酶，双酶切不成问题的
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jun8013

分步酶切，必要去磷酸化

军医

回复 274996064 的帖子
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前面都做了好多了，重新找就得返工了，我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时，在用CIAP处理，这样可以吗

军医

回复 ljzmy82 的帖子/ g4 K2 V3 ^+ }9 K
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都是NEB的酶

军医

回复 jun8013 的帖子# Z% ~8 U- [7 Z: r3 l3 X
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我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时，在用CIAP处理，NEB的酶里这两个酶有公用buffer的，用EcoRⅠbuffer.

lifescience1

回复 军医 的帖子5 W/ h- j$ @; k3 H; W1 }  x8 }
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如果两个酶的buffer相同的，即可共用的话 你可以将两个酶同时加入，不用一个一个的加入，, _/ O0 E/ V8 C4 e0 T, G8 k
还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。

lifescience1

回复 军医 的帖子& n1 a9 w! x  V2 v5 B3 T5 x

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还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。