求助双酶切的问题

军医

我用双酶切speⅠEcoRⅠ 双酶切，但是这两个酶切位点紧挨着，切了一会儿没切开，有没有人提提建议啊，该怎么办呢？谢谢了

274996064

这两个酶切位点要是离得很近的话是不能用这两个酶切的    他们中间最少要有6-10个碱基   我建议你重新找酶切位点

lifescience1

你所指的切了一会是多长时间 10分钟 还是1小时  ？! f  v/ r9 Z" b4 g) L
我们一般酶切的时间按是1到3个小时之间哈  只要EcoRI 和SpeI两个的酶切位点没有重复哪怕只相隔一个碱基都能切开哈。

ljzmy82

酶用的是哪个公司的呢，NEB的还是Femertens,还是用好公司的酶，双酶切不成问题的1 i) r9 d0 N/ B) n5 N) ?8 D/ S

jun8013

分步酶切，必要去磷酸化

军医

回复 274996064 的帖子- C: l! v# E+ H! p4 J' ^1 I9 N
3 A6 M; K5 h4 n5 j
前面都做了好多了，重新找就得返工了，我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时，在用CIAP处理，这样可以吗

军医

回复 ljzmy82 的帖子0 f6 W; f2 a$ t9 x, ^
4 j, T+ z. B- ], p9 E+ P9 c, n
都是NEB的酶

军医

回复 jun8013 的帖子
# T7 C- h8 f& U+ a) ^  L
+ [. [3 S6 Y; {& T我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时，在用CIAP处理，NEB的酶里这两个酶有公用buffer的，用EcoRⅠbuffer.

lifescience1

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* `; m6 b, k" Q8 e
" X# n6 r9 n* i  }! f如果两个酶的buffer相同的，即可共用的话 你可以将两个酶同时加入，不用一个一个的加入，
: b" O- O( G; M) \9 b2 z9 C% _4 b$ @还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。

lifescience1

回复 军医 的帖子7 v! \3 Y: T/ ~2 {$ B! [& b3 B( m
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如果两个酶的buffer相同的，即可共用的话 你可以将两个酶同时加入，不用一个一个的加入，
7 G" U1 W6 j1 Y: Z/ M; g% r* P+ P还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。