骨髓基质干细胞如何培养

骨道边

近两个月我一直在养骨髓基质干细胞，就是一直养不出来，希望有经验的同行指点一下啊。

athena1988620

你在用什么方法分？

骨道边

我就是直接中注射器冲洗下来的，因为我看到文献说全培养效果也可以且对细胞损伤小。
2 v% ^3 P6 z% r& \! K! h& B因为第一次养细胞啊，没什么经验，请指教。谢谢

iceyang

你详细说一下你养的是什么种属的BMSC，最好有你养的细胞照片传上来给大家看一下。

骨道边

好的，下次把图片拍下来给大家看看

骨道边

用的是C57BL小鼠

黑眼豆豆

我之前养过SD大鼠的骨髓间充质干细胞，就是用的全血贴壁法，养的蛮好的，你最好那你的步骤大概说说，我才能针对性的给你帮助。我建议你采取24小时半量换液法，既有利于干细胞的贴壁还能减少杂细胞（隔两天后第二次才全量换液并用PBS冲洗）24h内最好不要去观察细胞，以免晃动影响干细胞贴壁。一般到P3代，干细胞纯度很高用于实验了。

骨道边

步骤如下：一、C57BL小鼠8周左右三只，脱颈处死---75%酒精泡---取出骨头-----在泡酒精----移入培养皿中pbs冲洗-----再移到装有培养液的皿中分离软组织-----把弄干净的软骨切下来------把骨干放到装有10ml培养液的离心管中并插入冰中备用。& G1 t/ B0 p! x* x- j- T
二、切下来的软骨片剪碎----5ml胰蛋白酶消化20分钟消化----5分钟摇晃一次----然后吹打，吸掉上清，再用5ml的pbs漂洗----5ml二型胶原酶消化4小时---1500r/minx10min收集软骨细胞培养- j! ]9 E& ]$ ?( S1 o7 P! K1 m/ g
三、再把一中的骨干倒到一个新的皿中剪掉骨两端-----10ml的注射器吸取培养液强力冲洗骨髓数次直至发白-----移入一个培养瓶中培养( B, \/ m0 F2 {. d
（用到的培养液是L-DMEM含有10%的小牛血清）0 R* F5 f" X4 e( l, u( `8 R: I# @
干细胞的瓶4个小时后吸管慢慢吸出培养液进行第一次换液，目的是把造血干细胞吸掉，以后三天换液，可是看着什么也没有长出来。也不知道错在哪里

黑眼豆豆

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5 }2 M5 I# L8 g" G4 C5 ]# Y1、建议你处死老鼠浸泡十余分钟，取出骨头后，不要再浸泡酒精了！（注意无菌操作就可以了，我还没有出现过污染的情况，不放心就在培养基里添加双抗吧），在将软组织剔除干净后，用无菌PBS多冲洗几遍，将你所需的软骨组织切除下来后，用眼科剪小心剪开两端干骺端（最好别切除过多，BMSCs在干骺端的量比较多），用注射器吸取培养基缓慢冲洗骨髓，直到骨干发白，没有必要强力冲洗吧！（文献里多半还有200目过滤，我省了这步)
% z0 {' s# B0 L! @; w3 Y3 k, e2、至于首次换液的时间，我建议你改为24小时半量换液，换液时要十分轻柔的晃动一下培养液缓慢的倾斜瓶身，吸管吸除一半的培养基，再加入相应量的新鲜培养基就可以了。当然有英文参考文献首次换液时间甚至＜4h，这样的得到的细胞量肯定少，但是纯度高！咱的实验条件估计也很难做出来。我说的也只是我的实验经验，这个首次换液时间你自己在摸索看看吧。
" d2 ^' L& c  d. Y0 H# [    另外：我做的是SD大鼠，也是养BMSCs（4周龄SD大鼠）和软骨细胞（1周龄），你用8周龄的小鼠，细胞活性是否最佳，特别是软骨细胞，你最好查阅一下！我每次取材一只老鼠就够用，细胞长势喜人。不知道你一次取三只是分装几个培养瓶呢？

骨道边

谢谢指导。我就三个老鼠一个瓶，我也发现细胞太多了点，今天已经是第五天了吧，今天换液的时候还没有贴壁长的意思。而且我发现瓶壁上很脏，有好多小碎片，所以今晚我换液的时候就倒去原培养液后在用PBS洗一遍。还好一点。我本来是买的周龄很小的10只老鼠的，一次做几个，一直做不出来，剩下的老鼠就长大了。呵呵
7 B) ^: a  b( Y$ R我下次再做一个大鼠的看看，请问你用的培养液有什么要求吗？是否是细胞过多了也长不出来啊，一般这么估计密度啊？谢谢