脐血间充质干细胞分离培养问题（求高手解答）

仁心-妙术

明胶沉降红细胞，有时出现不分层现象？我用的分离液是Ficoll，离心分4层，最下层是红细胞层，第二层是淋巴细胞分离液，上方（白膜层）是少量红色的，最上层是血清层呈淡黄色。始终看不到白膜层不知道是什么原因？3天后首次换液，倒置显微镜下观察都是小的圆形的单核细胞和悬浮的造血干细胞（只有极少量单个存在的成纤维样细胞或者根本没有）。一般一周左右细胞就开始凋亡了。我用的培养基是阿尔法-MEM，20%血清GIBCO的。

ly200101042

我觉得有可能跟沉降红细胞后的稀释倍数有关
1 o# i1 |" t+ B& j5 k3 ^我们这是用羟乙基淀粉沉降红细胞7 B8 U- [6 l2 X6 l; G) s4 W
呵呵 不过我有时候根本就不沉降，因为时间长，而且效果一般。我直接将血液稀释一倍，按照1.5:1分离脐血，白膜层特别明显，不过就是有点费FICOLL

zixuaner

与离心速度和温度有关系吧

大少爷

脐血中间充质干细胞含量非常少，首先分离单个核细胞。 选择无各种产科并发症的健康足月产妇 ， 分娩后穿刺脐静脉抽取80m L脐带血液。 4 ℃冰箱保存， 1 2 h 内分离。首先离心（1880g，10min）去掉上层血浆。然后按照1:2的比例加盐水稀释，稀释血液缓慢叠加于Fic o l l上（2:1） ，我们用GE Healthcare Fillcoll-PaqueTM plus，400g，30min离心。以前用国产的分离液（天津TBD细胞分离液）840g，20min，白膜层特别明显，吸出乳白色云雾状单个核细胞， 洗涤离心 2 次， 将获得的单个核细胞分别 以5 × 1 0。的密度种植入2 5 c m。的塑料培养瓶 中， 加入 完全培养基 吹打 ，混匀。 置 于37 ℃ 、5 %的C 0 2饱和湿度培养箱中四五天开始出现少量贴壁细胞， 以梭形和多角形为主， 有的细胞至接近圆形(破骨样细胞) ， 细胞体积较大。6 d后出现较多贴壁的梭形细胞(间充质干细胞)， 并开始有集落的形七八天后形成2 0 — 4 0个细胞组成的克隆， 梭形细胞呈 “漩涡状”生长，四五周后细胞生长达8 0 ％ ～9 0 ％融合。用胰酶消化，梭形细胞先脱壁， 呈圆形， 破骨样细胞贴壁牢固不易被消化。收集脱壁细胞种植后，按1 ：3传代， 1 2 h 内完全贴壁， 变为梭形。传代后大部分细胞和其他杂细胞(包括破骨样细胞)逐渐被去除。至第3代剩下形态较为单一的成纤维样细胞， 呈漩涡状、 辐射状列， 即为脐带血源性的问充质干细胞 。

zg_zj_hz_xyj@ya

谢谢分享，下次试试！

henryjia

大少爷 发表于 2011-6-2 13:01 7 d' l$ p5 j' N+ m5 _3 ^, M8 w
脐血中间充质干细胞含量非常少，首先分离单个核细胞。 选择无各种产科并发症的健康足月产妇 ， 分娩后穿刺脐 ...

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完全培养基 - 指的是什么培养基？  破骨样细胞贴壁牢固不易被消化 - 可我的细胞几乎都不被消化？

湖南干细胞

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' b1 B- ^2 ?, J4 W- J  t* s谢谢分享，正好可以好好学习。

xuzhijuan1989

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7 [) Q0 \+ ^4 g% ~; I5 W+ [: S- Q7 v
谢谢分享，脐血MSC养了很久都没养出来，不知你的方法分离成功率高不高，可以一试。