全骨髓培养MSC的注意事项

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我的方法是抽取骨髓，全骨髓培养法。取2月龄兔，体重1.5kg左右，麻醉后剪去双侧髂嵴及胫骨术区皮毛，放入含500ml75%酒精桶中皮肤消毒。碘酊再次消毒皮肤，用含500U/ml肝素生理盐水1ml肝素盐水的5ml注射器及针头抽取髂棘部及胫骨骨髓4-5ml,移入4个含8-10mlDMEM的15ml离心管内，放入冰盒转移至培养房。吹打均匀后离心，1200rpm5分钟，PBS再洗一遍，离心。弃掉上清。加入适量培养基含10%FBS及双抗，移入T-25培养瓶,培养基量为4.5ml左右。镜下观察培养瓶内一片红，看不到细胞。不用管它，也不摇晃，就是不用碰培养瓶。48小时第一次半量换液。隔天全量换，这时候镜下观察可以发现变为梭型的MSC，零星的几个小细胞克隆团。以后3天换。镜下培养瓶见不均匀分布的细胞克隆群，有的大片地方没有细胞。待到11-14天有的细胞高度密集，这时1:1传代，含EDTA的胰酶消化大概2分钟，见细胞变皱缩变圆脱壁，培养基终止消化，离心。加入培养基接种培养瓶内继续培养，大概6-7天均匀铺满，进行P2代1:2或1:3传代。1:2传的话3-4天友可以铺满。1：3传的话大概6-7天。

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8 P( Z" J+ C8 h2 W我自己的体会是，形成了两三个很大很密的或者5-6个细胞集落，集落间没有细胞，大概11-14天左右，可以1:1传代了，如果等某个集落铺满的话再传代，那样要等很久，而且高密集的细胞容易老化或者分话，所以传代了就分布均匀，利于细胞的活力维持。

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个人做法认为，原来的瓶子很干净，消化前细胞的杂质不多的，可以继续传代用。觉得较脏的话就换新的培养瓶,T-25的培养瓶，PBS洗涤两次后，加入0.7-1ml胰酶含EDTA，消化2分钟左右（以镜下观察，细胞大多脱落为宜）后加入2倍胰酶量的完全培养基终止消化，冲洗后转移入离心管离心，去掉上清，加入培养基接种于培养瓶内，第三天换液。