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发表于 2011-6-16 11:26 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

一、肿瘤干细胞概述5 {( v" I7 p% E# s3 c$ `$ \- H5 F
肿瘤生物学的研究中最具吸引力的理论之一是肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)假说，该理论认为肿瘤是由一群功能异质性的细胞组成，只有一小部分具有干细胞特性的癌细胞才具有自我更新和分化成不同肿瘤细胞能力，在维持肿瘤的恶性增殖、侵袭、转移和复发等方面中起着决定性作用。+ D: E4 U: q: {2 R) H3 G
由此为针对一小群CSC特异靶向治疗肿瘤提供了理论依据，为解决肿瘤的治疗顽固性提供了新视角。尽管CSC理论应用于临床还有很多基本问题需要解决，但初步的研究表明通过特异性地靶向CSC来治愈肿瘤前景远大。实体瘤是当前癌症治疗中最具挑战的一类肿瘤。
二、CSC的起源假说
目前对CSC的起源问题仍存在争议。大致有以下三种CSC起源假说：9 E/ [& V$ u& Z# Y9 O/ o
1、CSC源自正常成体干细胞(normal stem cells，NSC)发生突变，多种因素引起NSC正常的更新分化调控机制过度激活而转化为恶性的CSC。支持CSC起源自NSC的证据最多，CSC与NSC有许多相似的特性并共享许多信号通路，是如此接近，若NSC长期处于致癌微环境下，DNA损伤修复无法有效完成，关键基因的异常激活或失活及信号通路的失调控，极有可能导致NSC转化为CSC。" b' H6 Q/ c- v( u) r
2、祖细胞在分化过程中发生突变获得自我更新能力终止分化，转化为CSC。( Y6 B# K( P. Q! d, w
3、成熟终末分化细胞因为突变获得自我更新和分化能力，转而形成CSC。
三、肿瘤干细胞特点) S2 e, }, K5 A
肿瘤干细胞与正常干细胞(NCS)有许多相似的特点。CSC也能通过自我更新和分化能力产生新的CSC和各种肿瘤细胞来维持肿瘤的生存和发展。但肿瘤干细胞是失调控的恶性细胞，相比正常干细胞有其独有特点：
1、致瘤性，极少数的CSC就可导致肿瘤的发生，而一般的肿瘤细胞很难形成克隆或体内成瘤。7 s% L% ~3 K& F; u* c6 d7 q
2、异质性，同一肿瘤中各种肿瘤细胞表现出显著的功能异质性，研究表明CSC间也有如是现象。在缺失BRCA1的小鼠模型中，细胞亚群CD44+CD24-细胞和CD133+细胞都能表现为相似的致瘤能力。9 a5 w, A" p$ S
3、耐药性，CSC细胞膜上大多表达ATP-cassette(ABC)家族膜转运蛋白，这类蛋白能将细胞毒素和抗肿瘤药物泵出细胞外，对多种化疗药物产生耐药性；同时CSC大多处于细胞周期的GO期，通过休眠状态来逃避化疗药物的攻击；CSC的DNA修复机制的强激活提高细胞内的氧自由基清除能力来增加DNA的修复能力从而引起治疗的失败。
4、转移性，在肿瘤组织中并不是所有的细胞都具有侵袭与转移能力，而EMT(epithelial-mesenchymal transition)常与CSC存在密切联系，CSC迁移前可能经历了EMT过程。
5、CSC比率变化大，CSC细胞既然有干细胞样特性，处于肿瘤细胞组织的顶端．在数量上应该维持在相对稳定的极少数。但实体瘤的结果表明CSC在同类型肿瘤中的比率变化差异相当大，可以在1％～20％范围内变动。黑色素瘤中ABCB5+型CSC的比率在1.6％～20％之间，结肠癌中CSC比率为1.8％～24.5％。
四、肿瘤干细胞筛选6 v* Y& E& y6 l: J# r4 p) s( \
目前主要从CSC生物学功能特点和其表面特异标志物两大方面来对CSC进行鉴定和筛选，联合使用多种方法也是切实有效的方法。
1、CSC筛选最常用的手段是利用CSC细胞表面特异标志物，通过流式细胞术或磁珠分选法分离得到CSC。CD133和CD44可用来分离实体瘤中的肿瘤干细胞，但目前还没有发现哪一种标志物特异地在CSC中表达，因此确定更多的CSC表面标志物及组合使用这些标志物将有助于提高CSC筛选的正确率。$ z: _/ t/ v8 L! a+ B5 u

表1 肿瘤干细胞常见的分子标记
2、根据肿瘤细胞中一群称为SP细胞(side population cell)能将核酸染料Hoechst33342排出胞外的特性，通过流式细胞术来分选，虽然一些SP细胞也具备自我更新和分化能力，但究竟是不是CSC还需进一步研究。2 w* g+ S, e9 a) x' I* |
3、根据CSC的克隆形成能力来筛选，将肿瘤细胞放在软琼脂培养基上培养，CSC在无血清添加生长因子条件仍具有很强的自我更新和保持非分化状态的能力，进而能形成克隆，而其他肿瘤细胞则在传代过程中消亡。  Y7 A5 k9 u) h% [9 {! z
4、鉴定CSC细胞的金标准是看分选得到的CSC能否在移植动物体内形成新肿瘤。将分离出来的各细胞亚群按不同细胞浓度梯度接种NOD／SCID小鼠比较各细胞群成瘤能力，从而筛选出优势细胞表面标志，或者将几种优势细胞表面标志进行组合，筛出各种组合的细胞群，这一方法又称系列原位移植法。- ]3 q) ^9 ?' L
5、非粘附球囊分析法相比于系列原位移植法更简便，逐渐被用来分选鉴定CSC，CSC细胞能在无血清添加生长因子的培养基中保持未分化状态并形成致密球体，非CSC则贴壁缓慢生长，CSC得以富集。非粘附肿瘤细胞具备裸鼠体内致瘤能力和分化能力，但非粘附肿瘤球囊细胞是否是由于渗人的正常干细胞引起的这效应还有待进一步证实。
五、肿瘤干细胞中的调节机制5 U; e, G1 H1 g
1、CSC基因改变
目前，细胞的恶性改变归因于基因的异常已得到公认，通过点突变、缺失或者重组等方式癌基因的激活或者抑癌基因的失活，导致细胞的恶性增殖。将这一理论应用于CSC，对研究CSC的起源不无裨益。已有证据证明，特定基因的改变在决定靶细胞的恶变中起至关重要作用，如PTEN抑癌基因的丧失会导致B-catenin活性的升高，这一过程被认为在正常干细胞向TSC转变中起关键作用。
在肿瘤中存在多种沉默基因，基因的沉默是DNA甲基化和组蛋白共价修饰相互作用的结果。已发现一些蛋白家族通过修饰组蛋白来控制基因表达，主要有三空腔结构蛋白(trithorax group，TrxG)和多梳状结构蛋白(polycomb group proteins，PcG)，在基因的调控中发挥相反的作用，如TrxG使H3K4(histone3lysine4)甲基化对基因的表达起正调节作用，而PcG作用于H3K27则抑制基因表达。异常的TrxG和PcG会导致基因表达改变，导致肿瘤形成。
2、CSC的调节通路% U6 B( d9 {" G9 o$ [( f2 I
经过大量的研究，已发现了调节干细胞的几条主要通路，如Notch、Hedgehog、WNT、PETEN及P53等，在调节干细胞自我更新与分化中发挥重要作用。目前，各通路中的主要基因及调节分子逐渐被人们所熟知(表2)，将成为抗癌治疗靶点。CSC与正常干细胞的基因及蛋白表达、调节通路具有很大的相似性，因此必须对CSC的分子机制充分了解，才能寻找CSC和正常干细胞的区别，为高效的临床诊断与抗肿瘤治疗提供线索。1 ^' A' v7 x; ^. J5 t& }
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表2 干细胞相关通路及作用靶点/ H) ^" A# c3 H: q( t! f" f; c* X7 A
六、肿瘤细胞的研究现状" \8 n5 w  b: Q, ^7 I' V' p
现在对肿瘤干细胞的研究主要是集中在干细胞的分离、鉴定和纯化以及各种肿瘤中干细胞的确认方面。
造血系统肿瘤：白血病是目前公认的由肿瘤干细胞引起的造血系统疾病，也是目前研究比较深入的一类疾病。park等人发现在白血病大鼠中提取的白血病细胞中仅有不到1%的细胞能在体外形成克隆，而且在体内形成克隆的也不过4%，这说明有少数白血病细胞能在体内外增生。Blair等人对急性髓性白血病的研究表明，不同的白血病细胞亚群移植到严重联合免疫缺陷病的裸鼠，其肿瘤细胞成瘤能力差异巨大，大部分的白血病细胞不能有效增殖，仅少数细胞有稳定持续的形成肿瘤克隆的能力。这些细胞的表面标志为[Thy-1-，CD34+，CD38-]，约占白血病细胞总数的0.2%-1%，而造血干细胞为[Thy-1+，CD34+，CD38-]，两者非常相似。所以，白血病干细胞可能来源于Thy-1-的祖细胞，或者是丧失了Thy-1+表达能力的干细胞。
脑部肿瘤：2003年Singh等从多种脑肿瘤中分离出肿瘤源性细胞。这些细胞具有神经于细胞分子标志CD133和巢蛋白，在体外培养可分化形成细胞表型与原位肿瘤类型相同的肿瘤细胞。2004年Galli等将这类细胞注射入小鼠颅内，在活体内产生了与原肿瘤类似的肿瘤，从体内研究进一步证实了脑肿瘤干细胞的存在。
乳腺肿瘤：2003年，AI-Hajj等从人的乳腺组织中分离出预期的乳腺癌起始细胞(Breast Cancer—Inition Cell，Brca-IC)。他们从乳腺癌的组织或胸水转移癌细胞中，根据细胞表面特异性的标志分离纯化出乳腺癌干细胞。这种细胞以in-ESA+CD44+CD24-／low为特异性细胞表面标志，虽然只占小鼠移植乳腺癌的2%，但其致瘤能力比未分类细胞大50倍，即只需200个此种细胞便可在小鼠乳腺中形成肿瘤。AI-Hajj等在接下来的实验中用Lin-ESA+CD44+CD24-／low细胞免疫小鼠，发现新形成的肿瘤与原来肿瘤的表型异质性相似，而且也仅Lin-ESA+CD44+CD24-／low细胞具有致瘤源性；与之相对的是，即使移植数千个其他表型的癌细胞，也不能形成移植肿瘤灶，这便充分证明了在NOD／SCID小鼠所形成的肿瘤灶内既包括这群肿瘤源性细胞，又包括其他表型的肿瘤细胞。
胰腺癌：胰腺癌细胞表面分子cD44、CD24和ESA的表达也存在异质性。Li等研究发现，从患者原发性肿瘤中分离出的胰腺癌细胞通过三种表面标志分子CD44、CD24及ESA进行分选后，接种至NOD／SCID小鼠中观察其成瘤性。结果显示，未经过流式分选的细胞在102～1O4个细胞范围内，接种后连续观察16周均无明显的肿瘤形成而经过CD44、CD24和ESA分选后的细胞致瘤性明显增强，其中CD44+CD24+ESA+的胰腺癌细胞虽然所占的比例很少(占0.2%～0.8%)，但致瘤性最强，只需100个即可在N0D／scID小鼠中形成肿瘤，并且在小鼠体内连续传代的肿瘤中，这群细胞的比例不发生改变。不仅如此，CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞作为胰腺癌干细胞的这一特征在组织学中也得到证实。CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞形成的移植瘤与患者的原发性肿瘤相比不仅病理表现十分类似，而且胰腺癌分子标志物的表达类型也非常相近。这些均说明CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞具有自我更新和多向分化等于细胞特征。+ z2 c6 m- z- n  M. E. z' `2 e
此外，在肺癌、肝癌及前列腺癌中也已进行了肿瘤于细胞的研究，更进一步证实肿瘤干细胞是肿瘤发生的根源。$ S! h9 E( h: ~

六、肿瘤干细胞研究的挑战4 a* O4 L+ b: c$ h* p& Z$ C# j8 [
现阶段，肿瘤干细胞的研究面临许多争议，在研究过程中也面临着许多问题。比如，CSC所占肿瘤细胞总数很少且同种肿瘤中CSC比率变化相当大0.1％～30％不等，给CSC的鉴定和分选带来困难。大多数肿瘤干细胞特异性标记仍不清楚，与正常干细胞有许多共性，缺乏有效的标记物去鉴别。同时肿瘤干细胞自我更新的机制、调节机理与小分子RNA间的关系还有待进一步研究。
研究思路：) s. @  q: ]# z* e
筛选出肿瘤干细胞，通过基因组测序研究他们与普通的癌细胞以及正常组织细胞的DNA层面的分子差异，挑选出相关基因以及他们所涉及到的重要信号通路，以阐明肿瘤干细胞自我更新以及调节机制。