大家来讨论下，关于人骨髓MSC细胞的来源、培养与软骨诱导

骨道边

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你好，我养的大鼠的干细胞，可是一直以来养都不成功，就是有时候出来一点的话就是长的很慢而且是死活多长时间都没完全铺满瓶底。再出不来我老板就准备放弃我了。你能帮帮我吗？
) C' K1 h. |4 `- M3 W我的具体步骤如下& V5 Q! w& F+ p8 t4 I
1 提取骨髓间充质干细胞  a# d( }% r1 n3 T
        150-180g的SD大鼠处死，解剖取下后肢，不要破坏股骨头关节面，从踝关节到股骨头部分，只把皮剥掉，还保留肌肉等软组织
) m. _" |0 X9 _% n/ T7 ?9 a& X        泡到75%酒精10分钟
; Z* A' Q9 i, l  {; d- o        移入超净台，用PBS漂洗两遍（培养皿中完成）
) \0 `6 U$ C; U9 V! s        移入一个新的培养皿中换用另一套解剖器械剃掉软组织，越干净越好& K9 E/ k) Q6 Q5 s% `" U
        从膝关节处分为两段
' p+ L. H. F4 \! p( z        移入装有10ml左右的PBS的培养皿中! i: ~% T. x. y) Z" _: o
        咬骨钳要掉长骨两端* J7 z5 k0 W# {1 o+ ^0 V
        5ml的一次性注射器吸取培养液冲洗骨髓，一般吹洗3-5遍
2 A7 A; p8 [. `9 s5 E. w        吸管吹匀冲下来的骨髓（不可用力过猛）. z. M  t! H8 |* l6 _
        收集到15ml离心管中1000r/minx10min离心弃上清
/ ?6 e8 z: ?2 K( r, O! r        8ml新鲜的培养液（15%新生牛血清的α-MEM）重悬细胞
7 H1 V7 ?! v9 j: p$ {( n$ |        移入培养瓶培养
) }5 b# ]% \8 b4 ?# E' j4 E$ @5 m# R        48h半液量换液
7 g) C5 j; \0 [( v        再24h后全量换液
2 A4 l# M8 T* S/ p+ y; p, N0 x" d( o        之后两三天换一次
% Z5 y+ X0 k% p4 R. n' u+ e        附：血清用的是gbico的，培养液是hyclone 的
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: C$ k3 F+ H" }% D8 ^2 }$ P
+ P& R+ ]6 x! {5 B/ d4 ?4 E9 Q我也做干细胞向软骨诱导的，现在一直处于起始阶段，细胞一直养不出来，不知道能不能把你的步骤和参数给我一份啊，救救小弟啊。不然我老板就对我彻底的失望了，那样的话结果就是准备放弃我了。谢谢了