求助：大鼠骨髓间充质干细胞为什么总是老化了--多图

hemu00

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请各位前辈帮忙分析分析为什么我养的大鼠骨髓间充质干细胞总是老化了。
4 d1 o4 A8 I2 V$ J0 [6 F我用的培养基是DMEM/F12和DMEM-LG（gibco瓶装液体培养基）加10%胎牛血清（gibco澳洲产），未加双抗。0.25%胰酶+EDTA消化细胞。. F2 @7 T/ o! m2 Q" g; Q8 I
动物选的是3-4周67g的SD大鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精中完全浸泡15min。无菌条件下取股骨、胫骨，完全培养基冲反复冲洗髓腔，双侧股骨和胫骨所得细胞平均接种入两个T25培养瓶（康宁），24h全量换液，72h全量换液前用HBSS洗两遍。3 a# n' m, b8 h/ W
图一
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图二
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" R  m; F) a" z; m. P7 p* Q图三8 W  q9 r# Y2 O0 u) I  E+ S/ O
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图四
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图五
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图六# f9 o0 ~0 q. H/ u& K
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图七8 v0 c* `8 J: t' O/ E
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图八  d6 Y$ t7 Z. |, {6 N: n* q4 Q: m

hemu00

回复 ljs 的帖子
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ljs前辈，我买的是Gibco的瓶装培养基，这个可以吗，会不会有假货的可能。体积的话是T25培养瓶加5-6ml。之前做过台盼蓝染色，活细胞是90%以上。还有怎么判断支原体污染呢？

hemu00

回复 金戈 的帖子
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斑竹，这些形态不典型的细胞是MSC吗？是MSC老化了还是其他杂细胞？

hemu00

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不是每次都计数，之前计数的时候一般是按1-3*10^5传代接种的，后面就换成1:2传代了。细胞活性不是100%，90%左右。说细胞老化是因为细胞不是长梭形的了，太扁平了，立体感不强。和之前在网上看到的invitrogen公司的rMSC产品图（P4的细胞）相比差别太大了，见下图' t& U: D) y5 ~# V' U+ U
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hemu00

都说细胞长起来之后要及时传代，各位前辈能不能提供一些细胞长到可以传代的照片呢？
4 J! }' L' _& ^: m2 m. {+ O原代培养的时候细胞集落长到多密需要传代，有些集落长得很快，同时其他地方都没有细胞也需要传代了吗？

hemu00

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# D( |8 T1 I/ R: v原代接种的细胞数量应该是不少的，方法是很多前辈推荐的（一只老鼠双侧股骨和胫骨冲出来的细胞平均接种到两瓶T25培养瓶）；DMEM/F12培养的第三天就80%融合了 很快  比文献说的第七天左右80%融合快多了。这样的话是不是接种的密度太大了呢？至于胰酶的消化问题，没有消化过的时候也不行（还有很多贴壁细胞就终止了），很是迷惑为啥细胞还是长不好

hemu00

回复 郝晓英 的帖子
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: Q6 S; R5 b2 {% F' |$ z" R$ ]% U谢谢英姐指导！下次换换自己配的培养基试试。现在传代之后是一代不如一代，和消化还是有关系的。

hemu00

回复 hxf_86 的帖子
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3 v2 Z9 T. h' m% Y' a' {* c谢谢建议，多交流，祝实验顺利！