求助：细胞传代后出现问题（胰酶消化问题）？

sherolily

我用胰酶消化传代到第2代后，细胞就开始老化（立体感不强，细胞平铺在培养瓶上），也不知道是不是分化了。
0 ?* t% ~! {' H        1 ：所用的胰酶含有EDTA ，EDTA对细胞有影响吗？
* F) L8 f1 F# ?- s: A5 v/ s        2 ：消化前胰酶在培养箱中预热到37度了。- x3 ?1 O' C" M- ^
        3 ：消化2-3min（速度慢一点就3min），然后终止，吹下细胞后，1000rpm，离心5min，然后用培养基（Gibco的DMEM-LG培养基，液体）悬浮，培养。
7 D1 n2 [1 b! Y; ^! x( u0 B# K. j" ^为什么出现这种现象呢？请大家帮忙分析一下吧！谢谢！！( Z/ s* n% ?8 f& q! S5 O

czzhaozhu

1. 你的细胞是哪类干细胞？$ w1 I2 {. A5 z2 l
2. 37度预热后的胰酶要作用2-3分钟时间，我个人认为时间太长了点，对细胞有影响，可能会增加细胞的死亡；而EDTA对细胞的影响倒是不大。

czzhaozhu

1. 你的细胞是哪类干细胞？
& h- n" [) U6 Q" z7 e2. 37度预热后的胰酶要作用2-3分钟时间，我个人认为时间太长了点，对细胞有影响，可能会增加细胞的死亡；而EDTA对细胞的影响倒是不大。

sherolily

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2 a, a+ A" P' T
1 v) H5 n* c" Z哦，我的是大鼠的BM-MSC，那请问你认为胰酶应该作用多久呢？我的胰酶浓度是0.25%，高吗？

snickle

细胞消化前的活力如何？密度大概是多少？是不是消化前本身细胞活力就比较弱，建议采用其他细胞做个对照，如果结果一样，可能是在操作过程中出现了问题。

bathpp2007

消化不要超过连分钟

shuangreny

可能和细胞种类有关，查查文献看是如何消化的

1301918986

消化BMSC我们应0.25%的胰酶，是不含EDTA的，一般消化三分钟也就差不多了，没出现你说的那种现象。

1301918986

还有，你的消化液ｐＨ是多少？

sherolily

回复 snickle 的帖子; ]/ T; J3 P6 i
: S4 W5 s! O0 |& c/ n
恩，密度大概在10^5左右，其他细胞是指什么细胞呢？我师姐跟我用一个胰酶做癌细胞，癌细胞没有问题