使用CD24CD44流式抗体标记测定乳腺癌细胞中干细胞比例的方法

lanxiubala

我想先检测一下乳腺癌细胞中的干细胞的比例，请问要用多少细胞上机？十的六次够吗？一瓶长满的MCF-7差不多是十的六次吧？

lanxiubala

没有做过关于流式抗体标记的实验，哪位做过啊？有没有具体的步骤呢？

lh_kitty

可以的，不过要设对照组，一般要求每个组细胞就要10^6细胞。

龙之吻

一瓶可以达到10的六次方，一般流式上机不低于10的五次方。注意吹打混匀细胞不要太用力。

daviddow

可以

amosummer

10的7次方可以好些，第一细胞量多，分选出来的阳性细胞相对容易检测，第二也能节省抗体的用量，因为6次方和7次方估计你用的抗体量身相当的，而且对后续实验也更好啊！

lanxiubala

回复 amosummer 的帖子1 L# e# q: y; d; }  U7 t

% K8 m8 A" u6 k: ^; t我买的是BD公司的流式抗体，一抗，1次试验可以做十的六次方个细胞。我现在是这么想的，先想检测一下干细胞含量，然后在做流式分选，主要也是考虑我没有做过流式抗体标记的试验，害怕第一次就做十次的抗体，万一失败了，很浪费；所以我现在就像先检测一下干细胞含量，顺便熟悉一下流式抗体标记的操作，如果能成功，再进一步分选。但是我现在不知道，做干细胞检测的时候，上机十的六次方个细胞是否能够将其中的干细胞（含量在百分之一到百分之四之间，也就是似的四次方个细胞）检测出来？

amosummer

回复 lanxiubala 的帖子) r5 z4 j8 v8 K

& B) K1 |6 f4 r" r流式还是很灵敏的，一个细胞都能检测出来，你的应该没问题。

lanxiubala

回复 amosummer 的帖子
# E$ i; `5 Z9 j5 R
* U1 P6 b7 F& \% ~$ ~6 h' W谢谢啦，请问你有没有做过流式抗体标记呢？具体步骤是什么呢？需要注意的地方有哪些？我是第一次做，很害怕失败。。。

RIVA2011

看你测得CD24和CD44应该都是胞外检测吧。一般步骤如下：  {  ~. w. G: U: Q
1．调整样本浓度，如有必要，用1*PBS 稀释为2×107 cells/ml； + x& h: B" {# z
2.管编号1#、2#、3#、4#，加100ul样本；
6 J2 Y7 H& _" I3 r+ g+ f3．按照下表加入抗体各10uL，混匀，室温避光反应15 分钟；4 D" m& ?; _9 q" Y  S: W
4．1*PBS 洗一遍；
7 o- T( p* b, j/ u5.离心，弃上清；3 v! @) U: U0 e
6．加500ulPBS重悬上机。  Q7 D2 `! G; i0 V
1#（对照管）        γ1  FITC                       γ1 PE
3 \# o. [- P6 o" `7 n2#（补偿管）        CD44 FITC         γ1 PE
+ v3 W6 E; E+ V0 H2 ^. x                           γ1  FITC                      CD24 PE 5 e3 A2 }( c' W% I+ L* ?
3#（试验管）        CD44 FITC        CD24 PE) J' Z0 ^* {1 H) M7 m3 X

, `: S1 q# b, A7 q" [- B