使用CD24CD44流式抗体标记测定乳腺癌细胞中干细胞比例的方法

lanxiubala

我想先检测一下乳腺癌细胞中的干细胞的比例，请问要用多少细胞上机？十的六次够吗？一瓶长满的MCF-7差不多是十的六次吧？

lanxiubala

没有做过关于流式抗体标记的实验，哪位做过啊？有没有具体的步骤呢？

lh_kitty

可以的，不过要设对照组，一般要求每个组细胞就要10^6细胞。

龙之吻

一瓶可以达到10的六次方，一般流式上机不低于10的五次方。注意吹打混匀细胞不要太用力。

daviddow

可以

amosummer

10的7次方可以好些，第一细胞量多，分选出来的阳性细胞相对容易检测，第二也能节省抗体的用量，因为6次方和7次方估计你用的抗体量身相当的，而且对后续实验也更好啊！

lanxiubala

回复 amosummer 的帖子3 n' ~6 y- B, G& n, ^

: y# s: n  H6 k/ A0 X9 r% B/ E& J我买的是BD公司的流式抗体，一抗，1次试验可以做十的六次方个细胞。我现在是这么想的，先想检测一下干细胞含量，然后在做流式分选，主要也是考虑我没有做过流式抗体标记的试验，害怕第一次就做十次的抗体，万一失败了，很浪费；所以我现在就像先检测一下干细胞含量，顺便熟悉一下流式抗体标记的操作，如果能成功，再进一步分选。但是我现在不知道，做干细胞检测的时候，上机十的六次方个细胞是否能够将其中的干细胞（含量在百分之一到百分之四之间，也就是似的四次方个细胞）检测出来？

amosummer

回复 lanxiubala 的帖子  t3 ]* m, _( [, h9 ^1 g5 s" u/ g
* x! Q9 M1 x+ c9 h* B! J: i9 i
流式还是很灵敏的，一个细胞都能检测出来，你的应该没问题。

lanxiubala

回复 amosummer 的帖子
/ A- }6 n! j0 N( ~% U; U- _5 L1 S. Y. Y
谢谢啦，请问你有没有做过流式抗体标记呢？具体步骤是什么呢？需要注意的地方有哪些？我是第一次做，很害怕失败。。。

RIVA2011

看你测得CD24和CD44应该都是胞外检测吧。一般步骤如下：
5 L. J; N6 i/ N9 Y+ U3 W0 a# e1．调整样本浓度，如有必要，用1*PBS 稀释为2×107 cells/ml；
3 u2 R4 \/ l  }2 ^2.管编号1#、2#、3#、4#，加100ul样本；- ]% s6 |5 l# q% i3 Q8 A
3．按照下表加入抗体各10uL，混匀，室温避光反应15 分钟；. v; s* p& S" b6 c! c2 |
4．1*PBS 洗一遍；
) Z% a$ C1 T# ~, u: @( b5.离心，弃上清；3 j! n7 ^9 ^: o3 y) N- j( ^
6．加500ulPBS重悬上机。5 S) S2 g4 D7 ?1 V. ^' Q
1#（对照管）        γ1  FITC                       γ1 PE
, Q  M; ~4 z; L9 a2#（补偿管）        CD44 FITC         γ1 PE
% m' I+ _6 E6 M                           γ1  FITC                      CD24 PE
( X  V  e: G8 q& c- o9 h! J3#（试验管）        CD44 FITC        CD24 PE. |2 M1 t% F) C7 S8 \

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