western-blot的抗原封闭原理

hany2007

无论是nc膜还是pvdf膜，都与蛋白具有非常强的亲和性，同样与与免疫球蛋白性质的抗体可非特异性结合。转膜完毕后，膜上除了我们的上样蛋白泳道会被上样蛋白结合，其余都是空白。所以必须用非特异性蛋白结合封闭。这样在杂交一抗时，一抗就只与目的蛋白结合，而后再与二抗孵育时，二抗也就主要与一抗结合。如果把封闭膜这杂交一抗两个步骤合并为一步，更多的可能是两种：1.曝光时全膜显色，黑乎乎一张黑板；2.目的条带无法检出，因为稀释一抗通常最低为1:1000，可以想一想，仅仅特异性的与目的蛋白条带结合的信号强度大，还是分散在全膜上的信号强度大！其实可以雪地追踪来打比方，干燥的土地上足迹难辨，若是雪地上，无论是人的足迹还是禽兽的蹄爪印迹，皆是一目了然。* `) Q' t1 a; Q* f1 S. P
封闭一般最好用脱脂奶粉，脱脂奶粉内的非特应性成分丰富，封闭效率高；但稀释一抗最好用BSA，BSA成分单一，可最大可能的避免抗体与稀释液成分非特异结合，从而可提高一抗的相对有效工作浓度，达到两个效果：1.增强信号强度。2.节省一抗。有时用BSA
3 c6 g, F. i/ @. E3 ~" F9 R1:3000稀释后曝光的信号强度比用脱脂奶粉1:1000的还强。二抗稀释还是用脱脂奶粉，目的还是为了减少非特异性结合，尽量减少背景杂带。
# i+ L# c; ?& }9 X呵呵，我就知道这么点，全都晒出来了，不妥之处，尚望拍砖。